I NOSTRI CONSULENTI

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Dr.ssa Giliola Spattini

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Dr. Luca Vezzoni

PRESENTAZIONE

Cari Colleghi,

vi presentiamo il MYLAV Book 2020 - 4° Volume della Collana Editoriale “Le Pillole di scienza” che raccoglie i più interessanti “Post di aggiornamento scientifico” pubblicati sul nostro Blog MYLAV nell’anno precedente.

Il Blog MYLAV (www.mylavblog.net) è lo strumento che dà voce ai nostri Consulenti ed Esperti Mylav e ci permette di pubblicare settimanalmente articoli di aggiornamento scientifico, consigli pratici e riassunti di articoli scientifici di recente pubblicazione.

Siamo “Il Laboratorio dei Clinici per i Clinici” pertanto tutti gli argomenti vengono trattati e discussi in maniera pratica e semplice come può avvenire in una discussione fra colleghi ma senza rinunciare agli aspetti tecnici e scientifici.

Il Blog MYLAV viene curato da Walter Bertazzolo e Ugo Bonfanti.

Tutti gli Autori dei Post sono Consulenti MYLAV e Collaboratori.

In versione e-Book e Audiobook.

Dir. Resp. Isidoro Grillo

COME EFFETTUARE UN CORRETTO CAMPIONAMENTO PER LA RICERCA DI DERMATOFITI

L’esame colturale per la ricerca di dermatofiti si esegue per confermare l’ipotesi diagnostica di dermatofitosi e per ottenere la tipizzazione del dermatofita. La tipizzazione del dermatofita permette di ipotizzare l’origine dell’infezione: in caso di isolamento di Microsporum canis la fonte è rappresentata molto probabilmente da un gatto, di Microsporum gypseum dal terreno mentre di una specie di Trichophyton mentagrophytes complex da un roditore selvatico.

La tipizzazione ci permette inoltre di valutare il rischio di trasmissione ad uomo o animali del dermatofita, che è molto elevato nelle infezioni da Microsporum canis, mentre è quasi nullo in quelle sostenute da Microsporum gypseum.

Foto 1 – fluorescenza positiva dei peli in un gatto con dermatofitosi da M. canis.

Per poter eseguire un corretto esame colturale per dermatofiti, è necessario rispettare alcuni passaggi che includono: la scelta dei peli, la metodica di campionamento e il corretto invio del materiale al laboratorio. Vediamoli nel dettaglio.

1) Scelta dei peli da campionare: la prima scelta è rappresentata da peli positivi alla lampada di Wood, che è una fonte luminosa che presenta la caratteristica di emettere radiazioni ultraviolette ad onda lunga comprese tra i 320 ed i 400 nm attraverso un filtro di nichel o di cobalto. I peli infestati da Microsporum canis emettono una caratteristica fluorescenza color verde-mela dovuta alla produzione di un metabolita del triptofano, la pteridina, prodotto solo da questo dermatofita (vedi foto 1).

Foto 2 – Alopecia, eritema e scaglie sul margine superiore della palpebra in un gatto con dermatofitosi.

Sia Microsporum gyp- seum che Trichophyton mentagrophytes complex non generano fluorescenza, per cui un risultato negativo con questo test non permette di escludere una dermatofitosi. In assenza di positività alla lampada di Wood, è sempre consigliabile, qualora presenti, campionare i peli o i loro frammenti al centro o all’interno della lesione alopecica (vedi foto 2).

I dermatofiti infatti determinano la rottura del pelo per cui i peli fratturati, riconoscibili in quanto più corti o, se fratturati nel punto di emergenza dall’ostio follicolare come piccoli puntini neri, saranno probabilmente più diagnostici rispetto a quelli localizzati alla periferia della lesione (foto 3).

Questi ultimi vanno prelevati solo se la lesione sospetta è completamente alopecica.

2) Metodica di campionamento: il prelievo va eseguito cercando di rimuovere il pelo dal follicolo pilifero, rispettando la direzione di crescita del fusto; questo accorgimento è essenziale per ridurre la possibilità di fratturare il fusto, lasciando nel lume follicolare la maggior parte del pelo infetto. La raccolta può essere eseguita con l’ausilio di pinze tipo mosquito, sulle cui branche sono stati applicati due piccoli tubicini di gomma per evitare traumatismi al pelo, oppure direttamente con le dita indossando dei guanti. In presenza di peli molto lunghi è indicato tagliare con un paio di forbici la punta del pelo. Il prelievo di piccolissimi frammenti di pelo che emergono dall’ostio del follicolo in lesioni alopeciche può essere eseguito mediante raschiato cutaneo superficiale utilizzando una lama di bisturi sterile rimuovendo delicatamente il materiale presente sulla superficie cutanea.

Foto 3 – alopecia in un cane con dermatofitosi. Si noti la presenza di frammenti di pelo infetti e fratturati riconoscibili come puntini neri.

3) Invio materiale al laboratorio: i peli vanno inseriti in una busta di carta da lettera per permettere all’operatore di raccoglierli con facilità per la semina in coltura. Va evitato il materiale in plastica, in quanto rende difficile la raccolta dei peli che tendono ad aderire alla superficie di plastica del contenitore. Non è necessario inviare grandi quantitativi di pelo: meglio pochi peli ben selezionati seguendo le norme precedentemente descritte.

Federico Leone, consulente di Dermatologia MYLAV

LA RICERCA DELLE METASTASI LINFONODALI: QUANTO È ACCURATA LA CITOLOGIA?

Nell’approccio diagnostico al paziente neoplastico, la ricerca di cellule metastatiche nei linfonodi drenanti la neoplasia è un passo fondamentale per una corretta stadiazione, utile a sua volta per ottimizzare la terapia ed emettere una prognosi. L’esame citologico è un strumento di indagine ottimale per questo scopo, data la ridotta invasività e la maggior velocità di esecuzione e processazione del campione.

Ma qual è la sensibilità e la specificità dell’esame citologico nell’identificare le cellule metastatiche nei linfonodi? Qual è il significato dei campioni non diagnostici? Che importanza ha campionare più di un linfonodo durante il processo di stadiazione?

Un recente studio dei colleghi dell’università di Edimburgo (Fournier et al. Veterinary Clinical Pathology 2018;47:489-500) ha cercato di dare risposta a queste domande, prendendo come oggetto di studio i tumori solidi del cane. Su un campione retrospettivo di 187 soggetti (di cui 32% con metastasi linfonodale), la sensibilità e la specificità dell’esame citologico, utilizzando come gold standard l’istopatologia, sono risultati essere rispettivamente 81% e 91%. Le false positività e negatività dell’esame citologico non sembrano dipendere né dalla dimensione del linfonodo campionato, né dal tempo intercorso tra il campionamento citologico e quello istopatologico (intervallo di tempo comunque non superiore a un mese). Gli autori hanno quindi suddiviso ed analizzato i casi secondo diverse categorie di neoplasia: per i carcinomi la sensibilità è stata massima (100%), dimostrando che l’esame citologico raramente è causa di falsi negativi in questo tipo di neoplasie.

Melanomi e mastocitomi hanno mostrato invece un numero maggiore di falsi negativi (sensibilità rispettivamente di 63% e 75%). Secondo gli autori, ciò è spiegato dalla difficoltà del patologo nel differenziare, nelle prime fasi dell’invasione metastatica, le cellule neoplastiche dalle cellule presenti fisiologicamente nel linfonodo. In particolare, per i melanomi, è spesso problematico distinguere i normali melanofagi (macrofagi contenenti melanina) dai melanociti neoplastici; analogamente, i mastociti normalmente e occasionalmente presenti nei linfonodi sono indistinguibili dalla maggior parte dei mastociti neoplastici.

La raccolta di un campione non diagnostico (25% dei casi esaminati) è risultato essere associata, prevedibilmente, a linfonodi non aumentati o lievemente aumentati di volume. Ciò è particolarmente vero per i linfonodi sottolombari, di per se difficili da campionare. È importante sottolineare come la prevalenza di metastasi in caso di linfonodi di normali dimensioni può arrivare fino al 40% in alcune neoplasie (ad esempio nel melanoma): è quindi consigliabile eseguire comunque l’exeresi chirurgica e l’esame istopatologico in questi casi, e non basarsi solo sull’esame citologico che ha più probabilità di condurre a risultati falsamente negativi o inconclusivi.

È stato inoltre visto che il 24% dei cani esaminati presentava metastasi in più di un linfonodo al momento della diagnosi. Ciò è stato descritto soprattutto per le neoplasie che colpiscono cranio, regione cervicale, perineo e scroto: in questi casi è frequente la presenza di cellule metastatiche anche nel linfonodo controlaterale alla sede delle neoplasia. In base questi risultati gli autori suggeriscono quindi di non limitarsi a campionare un singolo linfonodo durante il processo di stadiazione, ma di ampliare l’area di indagine.

Marco Giraldi, Ugo Bonfanti & Walter Bertazzolo

È POSSIBILE PREDIRE IL GFR DALLA CREATININA SIERICA?

È risaputo che la misurazione della creatinina sierica ha dei limiti oggettivi nella valutazione della funzionalità renale. In particolare la sua concentrazione ematica inizia ad aumentare solo quando la maggior parte dei nefroni risultano danneggiati e la velocità di filtrazione glomerulare (GFR) è significativamente diminuita.

Nell’uomo la concentrazione sierica della creatinina viene routinariamente utilizzata per stimare la GFR attraverso delle formule matematiche più o meno complesse, che includono, oltre al valore di creatininemia, anche una serie di dati morfometrici (ovvero dipendenti da misure corporee quali la stima della massa muscolare, età, sesso, ecc.).

Queste formule determinano una “GFR stimata” che si approssima sufficientemente a quella reale. Negli animali tuttavia simili formule matematiche non sono attualmente disponibili.

Un recente studio, pubblicato sul prestigioso Journal of Veterinary Internal Medicine (Finch et al, 2018), ha tentato di sviluppare una formula matematica utilizzabile nel gatto, basata sul reciproco della creatinina (il cosìdetto “indice di malattia renale”) e su una serie di misure morfometriche atte a stimare la massa muscolare. Il valore stimato della GFR è stato confrontato con il reale valore di GFR misurato mediante clearance dello ioexolo (vedi immagine a fianco in alto).

Purtroppo la formula così ottenuta non ha dato risultati incoraggianti e la correlazione tra GFR reale e stimata è risultata insoddisfacente. Inoltre la stima della GFR calcolata non ha mostrato nessun vantaggio rispetto all’indice di malattia renale (vedi immagine a fianco, indicante la correlazione tra GFR reale e reciproco della creatinina).

Attualmente possiamo quindi dire che nel gatto non è possibile stimare accuratamente la GFR, mediante formule matematiche che si basino sulla concentrazione della creatinina sierica e su dati morfometrici, come invece avviene nell’uomo.

Walter Bertazzolo

COME GESTIRE LE INFEZIONI COMPLICATE DEL TRATTO URINARIO

La gestione clinica delle infezioni del tratto urinario può essere tutt’altro che semplice. Molte di queste infezioni sono in realtà complicate da altri fattori predisponenti che possono renderle difficili da trattare. La conseguenza sono i comuni insuccessi terapeutici, frustranti per clinico e proprietario, oltre che pericolosi per il paziente.

Il nostro consulente per la nefrologia/urologia, Francesco Dondi, ha preparato un interessante documento che vi aiuterà nella gestione di queste patologie del cane e del gatto.

La gestione clinica delle infezioni del tratto urinario può essere tutt’altro che semplice. Molte di queste infezioni sono in realtà complicate da altri fattori predisponenti che possono renderle difficili da trattare. La conseguenza sono i comuni insuccessi terapeutici, frustranti per clinico e proprietario, oltre che pericolosi per il paziente.

Il nostro consulente per la nefrologia/urologia, Francesco Dondi, ha preparato un interessante documento che vi aiuterà nella gestione di queste patologie del cane e del gatto.

Le infezioni del tratto urinario si suddividono in UTI complicate e non complicate. Le UTI non complicate sono caratterizzate da:

• < 2 episodi/anno

• paziente non immunocompromesso

• non sono presenti alterazioni anatomiche metaboliche funzionali

• il paziente non ha ricevuto antibiotici nei 2 mesi precedenti

Le UTI complicate, invece, sono in infezioni che si verificano in pazienti con alterazioni anatomiche, funzionali o delle difese immunitarie sistemiche o locali dell’apparato urinario. Purtroppo, studi recenti riportano che molte delle UTI che vediamo nella pratica quotidiana siano di tipo complicato e richiedano un approccio più “aggressivo” sia in termini di trattamento che di monitoraggio, oltre che una diagnosi corretta.

Le UTI complicate si presentano in caso di:

- alterazione o deficit dei meccanismi di difesa (es.: integrità delle vie urinarie)

- danno alla mucosa uroteliale o flogosi (es.: urolitiasi, cateterismo)

- cateterismo urinario prolungato o permanente (UTI associate al catetere o CAUTI)

- alterazioni anatomiche delle vie urinarie (es.: stenosi uretrale nel gatto)

- alterazione nel volume urinario

- difetti funzionali (incapacità di svuotare la vescica o incontinenza)

- alterazione della composizione dell’urina (es.: glicosuria, proteinuria)

- presenza di patologie concomitanti che provochino immunodepressione (es.: diabete mellito, sindrome di Cushing, malattia renale cronica-CKD)

- terapia con steroidi o terapia immuno-

Un’altra caratteristiche del paziente con UTI complicata è quella di aver ricevuto antibiotici (a volte numerosi e utilizzati in modo “scorretto”) nei 2-3 mesi precedenti la presentazione.

Se pensate a quanto siano frequenti le condizioni sopra citate, è facilmente comprensibile come la maggior parte delle UTI che vediamo nella pratica quotidiana, siano oggi considerate complicate. In generale le UTI complicate possono avere ripercussioni sistemiche maggiori (flogosi sistemica, febbre, leucocitosi, insufficienza renale) e la loro terapia prevede l’utilizzo di farmaci antibatterici più “penetranti” e trattamenti solitamente prolungati (di solito > 3 settimane).

Gli esempi più di comuni di UTI complicate sono i seguenti:

- pielonefrite

- UTI in animali con urolitiasi

- UTI in animali con CKD o preesistenti nefropatie

- prostatite

- infezioni ricorrenti (≥ 3 episodi / anno)

DIAGNOSI

La diagnosi di UTI complicata prevede il riconoscimento dei fattori predisponenti citati in precedenza e l’identificazione di microrganismi nel tratto urinario. Per questo tipo di infezioni, ma ormai per tutte le infezioni del tratto urinario, l’esame batteriologico è imprescindibile.

Cosa serve per diagnosticare una UTI complicata:

- esame clinico e diagnostica di base per riconoscere i fattori predisponenti (es.: pielonefrite, urolitiasi o alterazioni anatomiche)

- analisi delle urine (raccolte per cistocentesi, cateterismo come 2°scelta, mai minzione spontanea perché serviranno per l’esame batteriologico)

- esame a fresco del sedimento (100-400X)

- citologia del sedimento (1000X)

- esame batteriologico

Tabella 1 - Principali batteri responsabili di UTI nel cane e nel gatto (Ohio State University Microbiology Laboratory, 2000-2007).

Tutti questi step sono importanti e ci danno informazioni tra loro complementari !

I batteri più frequentemente coinvolti nella patogenesi delle UTI sono di solito Gram negativi (75% circa dei casi), ed Escherichia coli rappresenta il batterio più comunemente isolato sia nel cane che nel gatto nelle UTI complicate.

Rarissimamente queste infezioni possono avere un’origine micotica (di solito sostenute da Candida spp.).

TRATTAMENTO E MONITORAGGIO

Il trattamento delle UTI complicate prevede la risoluzione dei fattori predisponenti che hanno portato all’instaurarsi dell’infezione. Questo aspetto è importante tanto quanto la terapia antibatterica, e in alcuni casi è un fattore imprescindibile. A volte purtroppo il problema sottostante che ha portato alla formazione dell’UTI è permanente e il paziente non potrà guarire dall’infezione se non temporaneamente (es.: problematiche neurologiche spinali permanenti).

Un concetto importante per le UTI complicate, ma in generale per le UTI e atri processi infettivi batterici, è la distinzione tra infezione ricorrente, recidiva, reinfezione e infezione refrattaria:

- Infezioni ricorrenti: ≥ 3 episodi / anno;

- Reinfezione: UTI che si ripresenta entro 6 mesi dal precedente trattamento, ma con

microrganismi diversi (eventualmente stessa specie batterica, ma diverso genotipo/sensibilità);

- Recidiva: UTI si ripresenta entro 6 mesi dal precedente trattamento, ma con stessi microrganismi; tipicamente perché non è stato eliminato dalla terapia (stesso patterno resistenza);

- UTI Refrattaria: permanenza del microrganismo nonostante diagnosi e trattamento corretti

In corso di UTI complicata l’esame batteriologico non ha solo un ruolo diagnostico iniziale, ma è fondamentale per il monitoraggio e soprattutto per decidere quando o se sospendere il trattamento antibatterico o modificare l’approccio farmacologico.

Di seguito vi riportiamo uno schema “ideale” per decidere la durata del trattamento ed il monitoraggio batteriologico delle UTI complicate.

Lo staff di Mylav

IL CAMPIONAMENTO IN MICROBIOLOGIA

Cari colleghi, parleremo oggi delle metodiche di corretto campionamento per eseguire un esame colturale da liquido sinoviale e vi daremo alcuni importanti aggiornamenti per eseguire l’emocoltura, di cui abbiamo già pubblicato un post in passato.

Per eseguire l’esame colturale da liquido sinoviale:

- • Rasare e disinfettare la cute prima di procedere all’artrocentesi.

- • Se disponibile, inserire il liquido in una provetta per emocoltura che fungerà così sia da terreno di trasporto che da terreno di arricchimento.

- • In alternativa inviare il liquido raccolto direttamente nella siringa utilizzata per il prelievo o in una provetta vuota sterile. Imbibire la punta del tampone con un po’ di liquido ed inviare solo quello potrebbe non essere sufficiente.

- • Per l’analisi del liquido sinoviale, è fondamentale avere anche un riscontro citologico. In questo caso parte del prelievo va inserito ANCHE in una provetta di K3EDTA, adatta per la citologia ma NON per il colturale. In alternativa potreste preparare direttamente gli strisci da liquido sinoviale e inviare per la citologia i soli vetrini.

- • Se possibile è utile anche inviare una biopsia della sinovia in modo da aumentare la probabilità di isolamento batterico. Ricordiamo che i campioni tissutali solidi vanno in provetta vuota contenente fisiologica sterile.

Vi sottoponiamo ora importanti aggiornamenti in merito alle metodiche di corretto campionamento per quanto riguarda l’emocoltura:

Quando è il caso di ricorrere ad un’emocoltura?

In tutti i casi in cui si sospetta nel paziente una setticemia, un’endocardite batterica o una meningite batterica, nei casi di febbre di origine sconosciuta, in corso di poliartrite, discospondilite, polmonite, pleurite e peritonite.

Come si esegue un’emocoltura?

- • Eseguire almeno DUE prelievi a distanza di tre ore l’uno dall’altro (o TRE a distanza di due ore l’uno dall’altro) rigorosamente PRIMA di qualsiasi terapia antibiotica (sono necessari almeno due prelievi poiché bisogna riuscire a prelevare il sangue quando i batteri sono in attiva replicazione; un solo prelievo potrebbe non evidenziare la replicazione batterica e dare un risultato falso negativo).

- • Il prelievo da emocoltura va eseguito rasando e disinfettando chirurgicamente l’accesso venoso. Ciascun prelievo deve essere di almeno 2,5-5 ml di sangue per il gatto e 5-10 ml di sangue per il cane (da valutare in base al peso e alla taglia dell’animale).

- • Ciascun prelievo va inserito in una bottiglia per emocoltura (vedi foto a fianco), quindi le bottiglie da inviare devono essere almeno due.

- • Ricordarsi sempre di cambiare l’ago ed utilizzarne uno nuovo per l’inoculo.

- • Per evitare possibili contaminazioni, è buona pratica apporre del cotone idrofilo imbevuto di alcool sul tappo di plastica del flacone ed assicurarlo con del cerotto.

Marta Medardo, Responsabile del settore di Microbiologia di MYLAV

L’EFFETTO DELLA LIPEMIA SULL’ELETTROFORESI

Ci capita spesso di ricevere richieste di consulenza allorché l’elettroforesi mostri tracciati allarmanti come quello indicato nell’immagine a lato. Si tratta di picchi molto accentuati e stretti in regione alfa-1, immediatamente dopo il picco delle albumine.

Solitamente non è nulla di preoccupante: si tratta semplicemente di un campione lipemico. Con lo strumento a nostra disposizione, le lipoproteine in caso di siero lipemico, migrano tutte insieme in quella regione determinando picchi che sono proporzionali all’intensità della lipemia, e quindi anche alla concentrazione di trigliceridi.

Per cui basta risottoporre un campione di siero non lipemico e ripetere l’elettroforesi, oppure più semplicemente, immaginare di “tagliare” quel picco e considerare il tracciato come se non esistesse.

Walter Bertazzolo

LA PROTEINURIA NEL PAZIENTE NEFROPATICO CRONICO

La proteinuria di origine renale è un’importante condizione patologica associata alla nefropatia cronica. È uno dei parametri cardine sui quali si basa la diagnosi e la stadiazione della nefropatia, sia nel cane che nel gatto, come raccomandato dalle linee guida della società internazionale IRIS, recentemente riassunte nel nostro blog dal Dott. Dondi.

(vedi http://www.mylav.net/blogc/view/219).

Perché è così importante valutare la proteinuria sia nell’iniziale approccio diagnostico dei soggetti nefropatici, sia durante il monitoraggio della patologia renale cronica?

In primo luogo, la proteinuria può essere il primo segno di danno renale, già nelle fasi precedenti all’iperazotemia. Ciò è particolarmente vero nei pazienti canini affetti da glomerulopatia, i quali presentano aumento del rapporto proteine urinarie / creatinina urinaria (PU/CU) oltre il valore di 0.5 nel 95% dei casi. Tutte le principali forme di glomerulopatia, quali l’amiloidosi renale, le glomerulopatie immunomediate associate a malattie infettive (per esempio la leishmaniosi), le glomerulopatie autoimmuni e le glomerulopatie su base genetica, hanno in comune la perdita di selettività della membrana glomerulare che si traduce nel passaggio nell’ultrafiltrato, e poi nelle urine, di una maggiore quantità di proteine e di proteine di maggior dimensioni (ovvero di peso molecolare superiore a quello dell’albumina), evento che definisce questo tipo di nefropatia come “proteino-disperdente”.

La proteinuria inoltre ha significato prognostico sia nel cane che nel gatto nefropatico?

il rischio di sviluppare crisi uremiche è 3 volte maggiore nei pazienti canini con PU/CU superiore a 1.0 rispetto ai soggetti con PU/CU minore d 1.0. Anche nel gatto, la probabilità di andare incontro a morte per malattia renale è 4 volte maggiore nei pazienti proteinurici (PU/CU >0.4) rispetto ai non proteinurici (PU/CU <0.2) e l’aspettativa di vita supera di poco l’anno nei pazienti con proteinuria persistente.

Infine, la proteinuria è uno dei target del piano terapeutico dei pazienti nefropatici, trattatabile attraverso l’utilizzo di diete cosiddette “renali”, di inibitori del sistema renina-angiotensina-aldosterone e, se supportato dall’esame istologico, di immunosoppressori.

Come va indagata inizialmente?

Il primo test di screening utile a indagare la proteinuria, come noto, è il dipstick urinario mentre la misurazione del rapporto PU/CU permette una più accurata quantificazione della proteinuria. Utilizzando il disptick, è necessario ricordare che valori di +1 (corrispondente a circa 30 mg/dL di proteine) possono essere considerati normali se ottenuti in urine con peso specifico elevato. Si veda la tabella sottostante, tratta ed adattata dallo studio di Zatelli et al (AJVR 2010), come linea guida utile per stabilire quando è davvero necessario eseguire il PU/CU nel cane, in base ai valori di concentrazione urinaria.

Nel gatto purtroppo il dipstick è meno affidabile nella determinazione della proteinuria, per cui nei casi dubbi è sempre meglio affidarsi alla valutazione del rapporto PU/CU. È inoltre importante fare attenzione ai falsi positivi ottenuti da urine venute in contatto con detergenti o con materiale fecale: questo è un evento che si può verificare quando le urine vengono raccolte da superfici precedentemente contaminate.

L’interpretazione della proteinuria nel paziente nefropatico cronico, sia utilizzando il dipstick che il rapporto PU/CU, dovrebbe sempre essere associata ad un contestuale esame completo delle urine con valutazione del sedimento (ed eventuale urinocoltura). Ciò è necessario perché le infiammazioni e le infezioni urinarie, le nefrolitiasi e le neoplasie del tratto urinario sono considerate causa di proteinuria post-renale e possono esitare talvolta in un aumento significativo del rapporto PU/CU. Pertanto, solo se queste patologie delle vie urinarie vengono escluse con gli opportuni esami clinici e di laboratorio, la proteinuria acquista valore diagnostico e prognostico della nefropatia cronica.

Nella prossima puntata dedicata all’argomento vedremo quali sono gli aspetti utili ad interpretare correttamente il rapporto PU/CU nel paziente nefropatico cronico. A presto, rimanete collegati.

Marco Giraldi & Walter Bertazzolo

Bibliografia

- Aresu L, Martini V, Benali SL, et al. European Veterinary Renal Pathology Service: A Survey Over a 7-Year Period (2008-2015). J Vet Intern Med. 2017; 27(Suppl 1): S67–10.

- IRIS Canine GN Study Group Diagnosis Subgroup, Littman MP, Daminet S, Grauer GF, et al. Consensus Recommendations for the Diagnostic Investigation of Dogs with Suspected Glomerular Disease. J Vet Intern Med. 2013; 27:S19-S26.

- IRIS Canine GN Study Group Standard Therapy Subgroup, Brown S, Elliott J, Francey T, et al. Consensus Recommendations for Standard Therapy of Glomerular Disease in Dogs. J Vet Intern Med. 2013; 27:S27-S43.

- Jacob F, Polzin DJ, Osborne CA, et al. Evaluation of the association between initial proteinuria and morbidity rate or death in dogs with naturally occurring chronic renal failure. J Am Vet Med Assoc. 2005; 226:393-400.

- Lees GE, Brown SA, Elliott J, et al. Assessment and management of proteinuria in dogs and cats: 2004 ACVIM Forum Consensus Statement (small animal). J Vet Intern Med. 2005; 19:377-385.

- Lemberger SIK, Deeg CA, Hauck SM, et al. Comparison of urine protein profiles in cats without urinary tract disease and cats with idiopathic cystitis, bacterial urinary tract infection, or urolithiasis. Am J Vet Res. 2011: 1407-1415.

- Siska WD, Meyer DJ, Schultze AE, Brandoff C. Identification of contaminant interferences which cause positive urine reagent test strip reactions in a cage setting for the laboratory-housed nonhuman primate, Beagle dog, and Sprague-Dawley rat. Vet Clin Pathol. 2017;46:85-90.

- Syme HM, Markwell PJ, Pfeiffer D, et al. Survival of cats with naturally occurring chronic renal failure is related to severity of proteinuria. J Vet Intern Med 2006; 20: 528-535.

- Vientós-Plotts AI, Behrend EN, Welles EG, et al. Effect of blood contamination on results of dipstick evaluation and urine protein-to-urine creatinine ratio for urine samples from dogs and cats. Am J Vet Res. 2018; 79: 525-531.

- Zatelli A, Paltrinieri S, Nizi F, Roura X, Zini E. Evaluation of a urine dipstick test for confirmation or exclusion of proteinuria in dogs. Am J Vet Res. 2010; 71:235-240.

QUALI INFORMAZIONI CI PUÒ FORNIRE LA CHIMICA URINARIA

La chimica urinaria fornisce una serie di “numeri” relativi a concentrazioni di numerosi analiti urinari, che per molti di noi possono assumere un significato oscuro (vedi screenshot a lato).

Con questo post cercheremo di chiarire il significato di questi analiti e di come poterli sfruttare nella pratica clinica. In particolare ci concentreremo sulla valutazione dell’escrezione degli elettroliti, mentre dedicheremo altri articoli agli altri analiti.

La quantità di analiti che viene escreta con le urine è il risultato della filtrazione glomerulare e del successivo riassorbimento di acqua e soluti nei tubuli renali e sono influenzati della quantità assunta con la dieta, dalla capacità di riassorbimento tubulare e dall’azione di ormoni regolatori (es. vasopressina, aldosterone, renina, ecc.). I reni modificano l’escrezione di acqua e soluti in base ai fabbisogni fisiologici, in modo da mantenere una omeostasi adatta alla vita.

Sebbene il metodo migliore per valutare l’escrezione di un qualsiasi soluto sarebbe la raccolta delle urine nelle 24h, a causa dei limiti pratici di questa procedura in ambito veterinario, sono stati sviluppati dei metodi alternativi (anche da campioni a spot e random) che possono comunque fornire una stima della perdita quotidiana di soluti per via urinaria. La chimica urinaria degli elettroliti fornisce sia i valori assoluti di concentrazione, sia le cosiddette Frazioni di Escrezione (Fe) di ogni soluto. Queste ultime sono un calcolo matematico semplice, che serve per confrontare l’escrezione di ogni singolo soluto con l’escrezione della creatinina. Dato che quest’ultima una volta filtrata dal glomerulo, non viene praticamente riassorbita o secreta in quantità significative a livello tubulare, rappresenta un buon termine di paragone. La Fe di un ipotetico soluto X, è il risultato del seguente calcolo:

FeX =[X urina] / [X plasma) x [Crea plasma] / [Crea urina]

Il dato finale viene può essere moltiplicato per 100 e quindi venir espresso in percentuale invece che come frazione di 1. È importante ricordare che questo calcolo, e quindi queste analisi di laboratorio, devono essere eseguiti da campioni di sangue e urine prelevate contestualmente nel paziente.

In questo modo, la Fe indica la frazione del soluto X che dopo essere stata filtrata dal glomerulo, viene escreta nelle urine. Se la Fe è <1 (o in termini percentuali <100%), significa che quel soluto ha un riassorbimento netto rispetto alla creatinina. Se invece la Fe è >1 (o maggiore di 100% in termini percentuali), significa che vi è una escrezione netta rispetto alla creatinina, e quindi che quel soluto viene anche secreto a livello tubulare. Più è bassa la Fe di un soluto, più significa che il rene sta preservando quel soluto dalla perdita urinaria.

In linea teorica, la chimica urinaria potrebbe essere utilizzata per aiutarci a comprendere le ragioni di numerose alterazioni elettrolitiche che incontriamo nella pratica quotidiana. Solo a titolo di esempio: se ho un paziente con ipopotassiemia causata da una perdita gastro-enterica, la risposta renale fisiologica dovrebbe essere quella di un recupero massivo di potassio; la chimica urinaria dovrebbe essere quindi caratterizzata da una bassa Fe di potassio. Viceversa se abbiamo un paziente con iperpotassiemia da cause non renali (es.: iatrogena), i reni dovrebbero rispondere eliminando molto più potassio e quindi la Fe di potassio in quell’animale dovrebbe essere aumentata.

Dobbiamo sottolineare però che il valore di Fe ha una significativa variabilità inter-individuale anche in condizioni normali, in quanto dipende da numerose condizioni fisiologiche, tra cui quantità di acqua assunta, dieta, distanza dal pasto, ecc. Pertanto, ottenere dei valori di riferimento delle Fe che abbiano un valore affidabile in senso assoluto è alquanto aleatorio

Le Fe sono utilizzate di routine in ambito di ricerca tossicologico/farmacologico per valutare possibili effetti nefropatici acuti post-esposizione ad un tossico o ad un farmaco. Purtroppo le stesse condizioni controllate e standardizzate che si possono realizzare in ricerca, sono ben lontane da quelle in cui vivono i nostri pazienti. Pertanto per anni, l’utilizzo prettamente clinico delle Fe degli elettroliti, è stato limitato. D’altra parte, studi recenti hanno mostrato che probabilmente la variabilità di questi risultati potrebbe essere minore di quello che pensiamo o abbiamo sempre pensato, soprattutto nel cane, e conseguentemente la chimica urinaria potrebbe trovare una possibile applicazione clinica in determinati setting.

Innanzitutto, sulla base delle conoscenze attuali, dobbiamo sottolineare che i valori di Fe hanno scarsa utilità clinica nella malattia renale cronica (anche se sono state valutate in alcuni studi sul metabolismo calcio e fosforo), nei casi in cui sia presente un diabete insipido o l’animale abbia subito trattamenti farmacologici e fluidoterapia.

Un recente studio ha mostrato l’utilità della misurazione degli elettroliti urinari in casi di sospetto morbo di Addison. In un animale in shock ipovolemico e disidratato, con tendenza all’iponatremia (es. per problemi primari gastroenterici), la risposta fisiologica attesa è una attivazione del sistema renina-angiotensina-aldosterone con tendenza al risparmio renale di aldosterone e quindi riassorbimento idrico conseguente. Ciò condurrà ad una natriuresi molto ridotta (FeNa molto bassa). In caso di assenza di aldosterone (come per l’appunto nell’Addison), l’escrezione renale di sodio risulterà invece abnormalmente elevata e inappropriata (vedi figura a lato). Questo risultato deve spingerci a confermare il sospetto clinico mediante il test di stimolazione con ACTH.

In un altro recente studio sono stati confrontate le Fe degli elettroliti in cani con danno renale acuto (AKI) responsivo alla fluidoterapia intensiva (e quindi reversibile) con quelli con forme più gravi di AKI associato a danno renale intrinseco e con prognosi più sfavorevole. I cani con forma responsiva alla fluidoterapia mostravano valori di Fe degli elettroliti molto più bassi, indicando indirettamente una funzione di riassorbimento tubulare mantenuta, rispetto ai cani con AKI da danno renale intrinseco. Lo stesso studio ha indicato come la Fe di molti elettroliti potesse avere un ruolo prognostico in questi pazienti.

Anche se la letteratura al riguardo è scarsa, la chimica urinaria potrebbe essere utile, infine, nella diagnosi e nella caratterizzazione di altre tubulopatie primarie o secondarie del cane e del gatto (es.: sindrome di Fanconi, acidosi tubulari renali), che tuttavia sono estremamente rare nella pratica quotidiana.

Ulteriori studi futuri potrebbero mostrare nuove applicazioni cliniche delle Fe degli elettroliti, vi terremo aggiornati!

Per chi volesse approfondire gli argomenti trattati, vi invitiamo a consultare la seguente bibliografia.

Walter Bertazzolo & Francesco Dondi

Bibliografia

Lefebvre HP et al. Fractional excetion tests: a critical review of methods ad applications in domestic animals. Vet Clin Pathol 2008.

Lennon EM et al. Urine sodium concentrations are predictive of hypoadrenocorticismin hyponatraemic dogs: a retrospective study. J Small Anim Pract 2018

Troia R et al. Fractional excretion of electrolytes in volume responsive and intrinsic acute kidney injury in dogs: diagnostic and prognostic implications. JVIM 2018

Waldrop JE. Urinary electrolytes, solutes, and osmolality. Vet Clin North Am Small Anim 2008

VALUTAZIONE DELL’IMMUNITÀ VACCINALE E CORTISONICI

I test di screening immunologico prevaccinale, valutano la presenza di anticorpi IgG circolanti contro le principali malattie infettive virali canine e feline, stimandone la concentrazione. Si basa su una metodica ELISA, che prevede il legame di anticorpi sierici del paziente ad antigeni purificati: tale legame viene identificato con anticorpi ant IgG canini o felini legati ad un enzima che svilupperà una reazione colorimetrica di intensità direttamente proporzionale al titolo anticorpale del paziente. Sebbene i vaccini siano in grado di stimolare sia l’immunità cellulo mediata che l’immunità umorale, solo quest’ultima si può quindi stimare tramite questo tipo di esami di laboratorio.

Alcuni colleghi ci hanno chiesto informazioni relativamente alla loro attendibilità in caso di pregresso trattamento con corticosteroidi. I titoli risulteranno falsamente diminuiti? Ci possono essere riduzioni del titolo a seguito della terapia precedentemente somministrata?

I corticosteroidi inibiscono la sintesi di numerose citochine pro infiammatorie (IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, TNF α, INFγ). Determinano inoltre riduzione dei linfociti T circolanti, inibizione delle linfochine e di conseguenza della risposta linfocitaria allo stimolo antigenico, inibizione dell’adesione cellulare e della chemiotassi di neutrofili e monociti. (Agnes E. Coutinho, 2011) Viene inibita soprattutto la risposta immunitaria aspecifica rispetto a quella specifica. Infatti terapie con glucocorticoidi a dosi antinfiammatorie non interferiscono con la produzione anticorpale. (Prontuario Terapeutico Veterinario, 2014)

In base a diversi studi è emerso che anche dosi immunosoppressive di glucocorticoidi non sembrano determinare una riduzione della produzione anticorpale, a patto che la terapia sia successiva all’immunizzazione primaria. Si è visto infatti che pazienti trattati con terapia immunosoppressiva successivamente alla vaccinazione, non hanno subito una riduzione rilevante di produzione anticorpale e una volta entrati in contatto con virus di campo, sono riusciti a contrastare il virus, nonostante le terapie immunosoppressive ricevute. (Greene, 2012)

La situazione cambia se la terapia cortisonica viene somministrata durante la prima serie vaccinale: in questo caso viene raccomandata la rivaccinazione (preferibilmente almeno 2 settimane dalla sospensione della terapia), poiché può esserci una riduzione della stimolazione linfocitaria se la terapia è stata somministrata precedentemente alla prima vaccinazione. (Greene, 2012; WSAVA, 2015)

Chiara Lisi & Walter Bertazzolo

Bibliografia

Agnes E. Coutinho, K. E. (2011). The anti-inflammatory and immunosuppressive effects of glucocorticoids, recent developments and mechanistic insights.

Greene, C. E. (2012). Infectious disease of the dog and cat.

Prontuario Terapeutico Veterinario. (2014).

WSAVA. (2015). Guidelines for the vaccination of dogs and cats.

COME QUANTIFICARE LA PROTEINURIA

Cari colleghi, in questa seconda puntata relativa alla valutazione della proteinuria, dedicheremo un ampio spazio alla spiegazione di come dovrebbe essere quantificata mediante il rapporto PU/CU.

Il metodo migliore per la valutazione dell’escrezione quantitativa di un soluto qualsiasi nelle urine, sarebbe quello di quantificarla nelle 24 ore. Tuttavia questa procedura richiederebbe la raccolta di tutte le urine nell’arco della giornata, poco praticabile in medicina veterinaria. La misurazione del rapporto tra la quantità di proteine e quello della creatinina in un campione urinario random, è stato dimostrato essere correlato in maniera accettabile con la raccolta nelle 24 ore. Inoltre questo rapporto viene poco influenzato dal metodo di prelievo e dal momento della raccolta.

La misurazione del rapporto PU/CU nel paziente nefropatico permette di determinare la gravità della proteinuria. In accordo con le linee guida IRIS, cani con valori di PUCU >0.5 e gatti con PUCU >0.4 sono considerati proteinurici e necessitano di trattamento specifico mentre, per entrambe le specie, un PU/CU <0.2 è ritenuto fisiologico. Per valori di PU/CU compresi tra 0.2 e 0.5 nel cane e 0.2 e 0.4 nel gatto la proteinuria è classificata borderline: in questo caso è raccomandato un attento monitoraggio ed eventuali ulteriori approfondimenti diagnostici, poiché la proteinuria borderline può rappresentare la fase iniziale della proteinuria conclamata.

Il PU/CU correla con la gravità del danno renale sia glomerulare che tubulo-interstiziale. Solo nelle fasi terminali il PU/CU tende a ridursi nonostante la gravità della patologia, per la drammatica riduzione di glomeruli e tubuli funzionali dai quali le proteine possono essere perse nelle urine. Il PU/CU >2.0 è suggestivo di danno glomerulare e, nel cane, i valori più alti sono descritti nelle glomerulopatie da immunocomplessi (PU/CU medio di circa 9.0) e nella amiloidosi (PU/CU medio circa 7.0). Nel gatto, specie prevalentemente affetta dalla forma tubulo-interstiziale idiopatica, la proteinuria patologica non è frequente, di solito è di modesta entità, correla con la gravità della fibrosi interstiziale e tende a comparire nelle fasi più tardive della nefropatia.

L’entità della proteinuria fornisce anche informazioni prognostiche: nel cane con nefropatia cronica un PU/CU >1.0 è associato ad un rischio di crisi uremica 3 volte maggiore rispetto ai cani con PU/CU <1.0. Nel gatto nefropatico cronico, il rischio di decesso dei pazienti proteinurici (PU/CU >0.4) è 4 volte maggiore rispetto ai non proteinurici ed è circa 3 volte maggiore nei soggetti borderline.

È importante quantificare periodicamente la proteinuria nei pazienti nefropatici per due motivi principali. In primo luogo perché i metodi analitici di chimica liquida utilizzati per misurare le proteine totali urinarie (quali il rosso pirogallolo, blu coomassie e benzetonio cloruro) sono più accurati rispetto ai metodi semiquantitativi (dipstick e acido solfosalicilico), soprattutto nelle fasi inziali della proteinuria e in caso di peso specifico urinario ridotto. Inoltre, è fondamentale avere un valore basale con il quale confrontare i successivi PU/CU e poter valutare eventuali progressioni della proteinuria. Riguardo quest’ultimo aspetto, nel cane è stato proposto uno schema (riportato nella tabella sottostante) con il quale è possibile determinare se la variazione del PU/CU nel tempo sia l’esito dell’evoluzione della proteinuria o se sia da attribuirsi alla normale variabilità giornaliera, dato che anche nei pazienti stabili il PU/CU può oscillare. Visto che la variabilità giornaliera del PU/CU aumenta, in valore assoluto, all’aumentare della proteinuria, è stato proposto di utilizzare la media artimetica ottenuta da più campioni raccolti in giorni consecutivi, in modo da avere un valore più prossimo al reale. Ciò è necessario per PU/CU >6.0: in particolare, per PU/CU compresi tra 6.0 e 8.0 sono necessari 2 campioni, 3 campioni se tra 8.0 e 10.0, 4 campioni tra 10.0 e 12.0 e 5 campioni per PU/CU >12.0. Per evitare eccessive spese per il proprietario, è possibile determinare un unico PU/CU su pool di surnatante urinario, avendo cura di refrigerare o congelare i campioni di urina per evitare variazioni preanalitiche del campione. In parole povere si potrebbe raccogliere l›urina per alcuni giorni consecutivi e inviare un pool rappresentativo (prendendo ad esempio 1 ml di ciascun campione di urina) oppure inviare le diverse urine richiedendo di effettuare solo una singola misurazione su un pool.

PU/CU iniziale

Valore necessario per dimostrare una diminuzione nei controlli successivi

Val ue necessario per dimostrare un aumento nei controlli successivi

0,5

<0,1

>0,9

1

<0,3

>1,7

2

<0,9

>3,1

4

<2,1

>5,9

6

<3,5

>8,8

8

<4,9

>11,1

10

<6,3

>13,7

12

<7,8

>16,2

Modificato da Nabity et al. 2007. J Vet Intern Med 21: 425-430.

Va sottolineato che questi dati riportati in tabella vennero ottenuti su una popolazione omogenea di cani con nefropatia familiare di razza stabile nel tempo, per cui non è scontato che possano essere applicabili anche a tutte le varie situazioni cliniche e nelle diverse razze canine o addirittura nel gatto.

Esistono altre variabili preanalitiche che possono incidere anche in modo significativo sul PU/CU e che possono rendere problematici diagnosi e monitoraggio della proteinuria:

– Le infiammazioni settiche o non settiche del tratto urinario e le urolitiasi determinano proteinuria post-renale (PU/CU >0.4 / 0.5) così come l’ematuria iatrogena, talvolta esito della cistocentesi, può aumentare il PU/CU. È necessario pertanto escludere il sedimento attivo nella valutazione della proteinuria renale. Va tuttavia considerato che questa influenza è significativa solo per sedimenti molto abbondanti.

– Il PU/CU ottenuto da urine di cani maschi interi e sani può essere costantemente borderline; la castrazione lo riduce nel range fisiologico (<0.2)

– Alcuni cani nefropatici proteinurici possono presentare PU/CU più alto se misurato da urine raccolte in ambiente clinico rispetto alle urine raccolte in ambiente domestico. In questi pazienti può essere utile mantenere la stessa procedura di raccolta delle urine per ridurre la variabilità preanalitica durante il monitoraggio della proteinuria. Sia nel cane che nel gatto il PU/CU non cambia se misurato su urine raccolte per cistocentesi o per minzione spontanea, fintanto che non vengono contaminate dal contatto con terreno o superfici.

– Utilizzando differenti metodi analitici, il PU/CU può differire fino a 0.1 – 0.2 punti: queste piccole oscillazioni possono essere importanti ai livelli borderline e di decisione clinica, in quanto possono far cambiare la stadiazione della gravità della proteinuria. È necessario tenere in considerazione questa variabile nel confrontare PU/CU dello stesso paziente ottenuti da laboratori diversi.

Nella prossima puntata vi parleremo invece della valutazione qualitativa della proteinuria mediante l’elettroforesi SDS su gel d’agarosio.

Marco Giraldi, Med. Vet., Staff del laboratorio MYLAV

Bibliografia

- Aresu L, Martini V, Benali SL, et al. European Veterinary Renal Pathology Service: A Survey Over a 7-Year Period (2008-2015). J Vet Intern Med. 2017;27(Suppl 1):S67–10.

- Bertieri M-B, Lapointe C, Conversy B, Gara-Boivin C. Effect of castration on the urinary protein-to-creatinine ratio of male dogs. Am J Vet Res. 2015;76(12):1085-1088.

- Chakrabarti S, Syme HM, Brown CA, Elliott J. Histomorphometry of feline chronic kidney disease and correlation with markers of renal dysfunction. Veterinary Pathology. 2013;50(1):147-155.

- Duffy ME, Specht A, Hill RC. Comparison between Urine Protein: Creatinine Ratios of Samples Obtained from Dogs in Home and Hospital Settings. J Vet Intern Med. 2015;29(4):1029-1035.

- Giraldi M, Rossi G, Bertazzolo W, et al. Evaluation of the analytical variability of urine protein-to-creatinine ratio in cats. Vet Clin Pathol. 2018;42:669–10.

Jacob F, Polzin DJ, Osborne CA, et al. Evaluation of the association between initial proteinuria and morbidity rate or death in dogs with naturally occurring chronic renal failure. J Am Vet Med Assoc. 2005;226(3):393-400.

- Nabity MB, Boggess MM, Kashtan CE, Lees GE. Day-to-Day variation of the urine protein: creatinine ratio in female dogs with stable glomerular proteinuria caused by X-linked hereditary nephropathy. J Vet Intern Med. 2007;21(3):425-430.

- Rossi G, Giori L, Campagnola S, et al. Evaluation of factors that affect analytic variability of urine protein-to-creatinine ratio determination in dogs. Am J Vet Res. 2012;73(6):779-788.

- Rossi G, Bertazzolo W, Binnella M, et al. Measurement of proteinuria in dogs: analytic and diagnostic differences using 2 laboratory methods. Vet Clin Pathol. 2016;45(3):450-458.

- Syme HM, Markwell PJ, Pfeiffer D, Elliott J. Survival of cats with naturally occurring chronic renal failure is related to severity of proteinuria. J Vet Intern Med. 2006;20(3):528-535.

- Vilhena HCR, Santos RR, Sargo TJ, et al. Urine protein-to-creatinine concentration ratio in samples collected by means of cystocentesis versus manual compression in cats. J Am Vet Med Assoc. 2015;246(8):862-867.

L’EFFETTO DELLA CONTAMINAZIONE EMATICA SULL’ESAME DEL LIQUOR

Vi siete mai chiesti quanto e come può influire la contaminazione ematica al prelievo, sui risultati dell’esame del liquor, in particolare per quel che concerne il numero di RBC, di cellule nucleate e sulla concentrazione proteica?

Non esistono pareri concordi sull’argomento, e diverse fonti bibliografiche riportano metodi di correzione contraddittori su come modificare i risultati del liquor in base alla quantità di eritrociti presenti nel campione.

Un recente studio pubblicato su Veterinary Clinical Pathology (MacNeil et al, VCP 2018; 47: 464-470) ha valutato il possibile effetto confondente della contaminazione ematica in due modi differenti:

1) Retrospettivamente, attraverso un’analisi statistica dei risultati nel database del laboratorio dell’Università del Colorado. I campioni con una sospetta contaminazione ematica iatrogena (108 campioni di LCR), sono stati confrontati con quelli privi di contaminazione (679 campioni di LCR), al fine di valutare se esistessero differenze significative in numero di RBC, cellule nucleate e concentrazione proteica. Come vedete dall’immagine sotto, non sembrava esserci una differenza evidente in termini di conteggio cellulare e concentrazione proteica, a dispetto della diversa quantità in RBC.

2) Prospetticamente, creando delle contaminazioni seriali di campioni di liquor con quantità fisse di sangue, al fine di creare una contaminazione ematica fittizia. I campioni così contaminati sono stati analizzati per verificare l’effetto atteso. Anche in questo caso, a dispetto di una crescente contaminazione ematica indotta artificialmente, il numero di cellule nucleate e la concentrazione proteica non sembravano modificarsi significativamente (vedi immagine sotto in 10 campioni di liquor modificati artificiosamente).

Gli autori concludono quindi che non è possibile stabilire una relazione matematica affidabile che possa correggere il numero di cellule nucleate e la concentrazione proteica, in base alla quantità di eritrociti nel campione. La presenza di un elevato numero di cellule nucleate o un’abnorme concentrazione proteica non dovrebbero pertanto venir giustificate dalla sola contaminazione ematica iatrogena indotta dalla centesi, e dovrebbero pertanto essere conseguenti ad un processo patologico in atto.

Walter Bertazzolo, Dirtettore Scientifico del Laboratorio MYLAV

ACIDI BILIARI SIERICI O URINARI: QUALI SCEGLIERE?

Molti clinici ci chiedono se siano meglio gli acidi biliari sierici pre e post-prandiali oppure quelli urinari. Prima di cercare di rispondere a questa domanda, bisogna fare alcune premesse:

1) La concentrazione degli acidi biliari viene utilizzata dai clinici come test specifico di funzione epatica, ma bisogna ricordarsi che la loro concentrazione dipende anche da eventuali problemi gastroenterici (come il malassorbimento, la disbiosi, ecc.), in quanto nel metabolismo degli acidi biliari, gioca un ruolo fondamentale il ricircolo portale entero-epatico e la metabolizzazione di queste molecole da parte dei batteri intestinali. Pertanto una inaspettata alterazione nella loro concentrazione potrebbe dipendere anche da eventuali problematiche grastroenteriche.

2) La maggior parte degli animali sani ha concentrazioni di acidi biliari molto basse, ma inspiegabilmente alcuni cani possono avere fisiologicamente dei valori molto più elevati. È noto ad esempio come nei maltesi sani sia frequente avere valori di acidi biliari sierici pre e post-prandiali molto elevati (Tisdall et al Aus Vet J 1995). In questi casi può essere davvero difficile stabilire quale cut-off utilizzare per discriminare tra un maltese sano ed uno patologico.

3) Tattandosi di un test di funzione epatica, è plausibile aspettarsi acidi biliari elevati in tutte quelle epatopatie che conducono ad una ridotta funzione epatica. Potranno essere pertanto presenti anche altri riscontri di laboratorio con lo stesso significato (es. ipoazotemia, ipoglicemia, ipoalbuminemia, iperbilirubinemia, ecc). Nelle anomalie vascolari congenite (shunt), l’aumento degli acidi biliari è spesso l’unica alterazione di laboratorio della funzione epatica.

4) Se un animale ha una epatopatia associata ad ittero, testare gli acidi biliari è completamente inutile: verranno elevati sicuramente, in quanto l’iperbilirubinemia causata da patologie epatiche o post-epatiche/ostruttive è associata sicuramente ad un deficit di funzione epato-biliare, non c’è bisogno di confermarlo in altro modo.

5) Quando si dosano gli acidi biliari sierici, è sempre consigliabile fare sia i pre che i post-prandiali. Infatti non è infrequente, ottenere dei valori pre-prandiali molto più elevati dei post-prandiali. Questo può dipendere da una precoce contrazione della cistifellea a digiuno, da concomitanti patologie gastroenteriche, da un alterato svuotamento gastrico, ecc. Misurando solo gli acidi biliari pre-prandiali correremmo il rischio di diagnosticare troppo spesso una insufficienza epatica.

Ma allora quale devo scegliere? Sulla base dei risultati della letteratura, l’accuratezza diagnostica degli acidi biliari sierici (pre e post-prandiali) e di quelli urinari è molto simile. Pertanto molti clinici preferiscono utilizzare le urine, perché hanno il grosso vantaggio di richiedere un solo campionamento, possono essere raccolte direttamente dal proprietario e ovviamente, trattandosi di una singola determinazione, costano meno. Nell’esperienza di molti internisti tuttavia non è infrequente ottenere valori di acidi biliari urinari border-line, difficili quindi da interpretare.

In generale, io e il team di consulenti internisti di MYLAV, suggeriamo sempre di utilizzare, se possibile, prima gli acidi biliari sierici, sempre facendo pre e post-prandiali per i motivi sopra esposti. Se fosse problematico eseguire due prelievi ematici, i valori urinari possono essere una alternativa valida, tenendo conto di alcune considerazioni importanti:

A) Considerate significativi solo aumenti molto rilevanti della concentrazione urinaria, non fidatevi di piccoli aumenti.

B) Cercate di eseguire la raccolta delle urine dopo 4-8 dal pasto: questo accorgimento aumenta le probabilità di rilevare un aumento significativo in caso di epatopatia (Center 2010, ECVCP Proceedings).

C) Come per molti altri analiti urinari, considerate solo il valore normalizzato in base alla concentrazione della creatinina urinaria, non il valore assoluto.

Walter Bertazzolo, Direttore Scientifico di MYLAV

Bibliografia

Balkman et al (2003). Evaluation of urine sulfated and non-sulfated bile acids as a diagnostic test for liver disease in dogs. JAVMA 222: 1368-1375.

Tisdall et al (1995). Post-prandial serum bile acid concentrations and ammonia tolerance in Maltese dogs with and without hepatic vascular anomalies. Aus Vet J 72: 121-126.

Trainor et al (2003). Urine sulfated and non-sulfated bile acids as a diagnostic test for liver disease in cats. J Vet Intern Med 17: 145-153.

SEI SICURO CHE CI SIA UN PROBLEMA COAGULATIVO?

È una delle consulenze che riceviamo più spesso: ho fatto un profilo coagulativo, magari anche banalmente un prechirurgico in un animale apparentemente sano, e ho la coagulazione con alcuni valori alterati. Che faccio?

Ebbene prima di pensare che il vostro paziente abbia una qualche forma di coagulopatia congenita o acquisita, è molto importante essere certi che i risultati anomali ottenuti non siano il risultato di problematiche preanalitiche, molto comuni nella coagulazione.

Ad esempio:

1) Hai avuto problemi durante il prelievo di sangue? (per esempio hai impiegato troppo tempo, hai eseguito una emostasi eccessiva, ecc.)

2) hai controllato che le provette usate siano effettivamente adatta per il profilo coagulativo? devono avere un rapporto tra anticoagulante e sangue pari a 1:10

3) hai controllato di aver messo la giusta quantità di sangue nella provetta dedicata?

4) hai separato in tempi sufficientemente brevi il plasma citrato o te lo sei scordato nella centrifuga?

5) hai conservato il plasma a temperatura ambiente o in congelatore? se lo hai messo semplicemente in frigo a 4°C è possibile purtroppo avere allungamenti artificiosi dei tempi di coagulazione, in particolare dell’aPTT. Per analisi eseguibili in 24h la temperatura ambiente è l’ideale, ma se necessiti di conservare il campione per più tempo è meglio congelarlo.

6) nel dubbio di possibili errori preanalitici, riprova a fare la coagulazione, per verificare se quelle alterazioni sono consistenti e costanti.

Solo se tutti questi aspetti preanalitici sono stati verificati e rispettati, puoi iniziare davvero a ricercare un problema clinico.

Walter Bertazzolo, Direttore Scientifico di MYLAV

IL CONSENSUM DELL’ACVIM SULLA DIAGNOSI DELLE ANEMIE EMOLITICHE IMMUNOMEDIATE

La prestigiosa rivista Journal of Veterinary Internal Medicine ha recentemente pubblicato le linee guida per la diagnosi ed il trattamento dell’anemia emolitica immuno-mediata (AEIM) del cane e del gatto. Parliamo oggi degli aspetti diagnostici, focalizzando la nostra attenzione sui punti più importanti della pubblicazione. Per chi volesse leggerla integralmente, vi alleghiamo il PDF originale che potete anche scaricare liberamente dal sito della rivista.

C’è da sottolineare che queste linee guida riguardano solamente le forme di AEIM (rigenerative e non) che hanno comunque come target gli eritrociti maturi e non le forme immuno-mediate che hanno invece come target i precursori midollari.

Un secondo aspetto da sottolineare è che non viene riconosciuto un singolo gold-standard per la diagnosi di AEIM. Si sottolinea invece che la diagnosi deve basarsi su diversi rilievi clinicopatologici (vedi algoritmo sotto, tratto dall’articolo allegato), oltre che sulla risposta ai trattamenti specifici.

Il principale criterio ematologico morfologico è la presenza di una consistente sferocitosi, da valutare in una porzione dello striscio ben preparata ed in monostrato, nel quale ci siano almeno >3-5 sferociti per campo ad immersione a 1000x.

La ricerca di immunoglobuline adese sulla superficie degli eritrociti può essere ricercata mediante il test dell’autoagglutinazione (con sangue diluito con un eccesso di fisiologica), mediante il Coomb’s test o la citofluorimetria, in ordine decrescente di accuratezza diagnostica.

L’emolisi alla base della patogenesi dell’AEIM è confermata dalla presenza di ittero, iperbilirubinemia, bilirubinuria ed eventualmente emoglobinuria (in caso di emolisi intravasale).

Infine in questa review sistematica della letteratura, si è cercato anche di capire se ci fossero dei possibili fattori scatenanti o comorbidità particolarmente associate nelle AEIM del cane del gatto, che potessoro quindi giocare un ruolo eziopatogenetico. Dai dati piubblicati nell’articolo, sembra che solo le malattie infettive e il trattamento con farmaci (in particolare alcuni antibatterici nel cane) possono favorire l’innesco della malattia autoimmune. Tuttavia, tra le malattie infettive, solo Babesia gibsoni nel cane e Mycoplasma haemofelis nel gatto sembrano davvero essere implicate nella AEIM. Tutte le altre comorbidità (infettive, farmacologiche/vaccinali, neoplastiche o patologie di varia natura) non sembrano invece essere potenzialmente responsabili di AEIM.

https://www.mylavblog.net/attachments/article/Garden_et_al-2019-Journal_of_Veterinary_Internal_Medicine.pdf

Walter Bertazzolo, Direttore Scientifico di MYLAV

IL CONSENSUM DELL’ACVIM SULLA TERAPIA DELL’ANEMIA EMOLITICA IMMUNOMEDIATA

L’anemia emolitica immuno-mediata (AEIM) è una patologia comune nel cane, con elevati tassi di mortalità, in parte legati anche agli effetti collaterali dei farmaci che vengono utilizzati per cercare di annullare la risposta auto-immune contro gli antigeni eritrocitari. Recentemente, sul Journal of Veterinary Internal Medicine (Swann et al, JVIM 2019; 33: 1141-1172), sono state pubblicate le linee guida per la diagnosi e la terapia di questa patologia. Nel blog precedente abbiamo discusso gli aspetti diagnostici, vediamo ora di affrontare quelli terapeutici nella specie canina. Riportiamo qui gli aspetti principali, rimandando gli interessati a consultare direttamente la pubblicazione originale per i dettagli (vedi PDF allegato).

1) Tempistica del trattamento: i trattamenti devono essere iniziati appena terminata la raccolta di tutti i dati diagnostici, in particolare quelli di laboratorio, in modo da non inficiare la diagnosi e di avere nel contempo un intervento quanto più tempestivo possibile.

2) Utilizzo della trasfusione di eritrociti concentrati (o in alternativa di sangue intero): l’utilizzo di RBC concentrati deve essere preferito in quanto i pazienti con AEIM sono normo-volemici e possono andare incontro ad ipervolemia se trattati con sangue intero. La trasfusione è consigliata allorché siano presenti chiari disturbi riferibili a una ridotta ossigenazione dei tessuti e devono quindi essere decisi di caso in caso, in base alla velocità del processo emolitico, alle condizioni cliniche del paziente, alla presenza di iperlattatemia, ecc. Non vengono quindi consigliati dei valori limite di ematocrito al di sotto dei quali la trasfusione è consigliata, in quanto non sono applicabili a tutti i casi. Gli eritrociti concentrati non devono avere più di 7-10 giorni di età, per ridurre il rischio di reazioni emolitiche trasfusionali. L’utilizzo di eritrociti concentrati deve essere preferito alle soluzioni emoglobiniche in quanto queste possono causare più reazioni avverse. Si sconsiglia l’uso di plasma fresco per il trattamento della eventuale coagulazione intravasale disseminata (DIC).

3) Trattamenti immunosoppressivi: sono alla base della terapia delle AEIM, di seguito un riassunto dei farmaci consigliabili.

a) Corticosteroidi: si raccomanda prednisone PO a 2-3 mg/kg die in singola somministrazione o diviso in due somministrazioni. Per i cani >25kg si consigliano 50-60 mg/m^2 die. Se il paziente inizialmente non riesce ad assumere farmaci PO, si consiglia di iniziare con desametazone a 0,2-0,4 mg/kd die per IV. Non si consigliano dosaggi superiori in quanto si può indurre semplicemente un aumento degli effetti collaterali ma non effetti benefici garantiti. Il dosaggio del cortisonico andrebbe ridotto dopo 1-2 settimane se ha dato un effetto benefico.

b) Il trattamento cortisonico va ridotto del 25% allorché l’ematocrito>30% per almeno 2 settimane dopo l’inizio del trattamento e sono migliorati gli indicatori di emolisi (sferocitosi, bilirubinemia) e rigenerazione. Si suggerisce di ridurre ulteriormente la dose del 25% ogni 3 settimane sempre in caso di condizioni stabili. Se il cane assume un secondo immuno-soppressore, questo non va ridotto ma si deve ridurre del 50% il dosaggio del cortisonico. I trattamenti complessivamente dovrebbero durare 3-6 mesi (per i cortisonici) e 4-8 mesi (in caso di utilizzo di un secondo farmaco non steroideo).

c) I farmaci alternativi o in associazione ai cortisonici sono:

1. 1. Azatioprina: 2 mg/kg o 50 mg/m^2 PO ogni 24h, per 2-3 settimane. Successivamente la dose va ridotta somministrandola a giorni alterni

2. 2. Ciclosporina: 5 mg/kg PO ogni 12h

3. 3. Micofenolato: 8-12 mg/kg PO ogni 12h

4. 4. Leflunomide: 2 mg/kg PO ogni 24h

5. 5. L’evidenza scientifica relativa ai reali vantaggi dell’utilizzo di questi farmaci è tuttavia molto debole. Si sconsiglia fortemente l’utilizzo di ciclofosfamide.

6. 6. Immunoglobuline per IV: sono consigliate solo in caso di mancata risposta ai trattamenti convenzionali e solo come emergenza (trattamento salvavita), non come trattamento di mantenimento.

7. 7. L’utilizzo di 3 o più trattamenti immuno-soppressivi è sconsigliato
d) Si suggerisce un ulteriore immuno-soppressivo oltre al cortisonico in caso di:

1. 1. La situazione del paziente è gravissima

8. 8. L’ematocrito si riduce >5% al giorno per i primi 7 giorni, a dispetto del trattamento corticosteroideo

9. 9. Il paziente è mantenuto in vita con continue trasfusioni

10. 10. L’animale sviluppa gravi effetti collaterali indotti dai cortisonici

Valori elevati di urea e bilirubina sono sconsiderati fattori prognostici negativi durante il trattamento. Si suggerisce di controllare l’emogramma ogni 1-3 settimane durante il mantenimento, per decidere gli eventuali cambiamenti di dosaggio dei farmaci immuno-soppressori.

4) Controllo degli effetti collaterali: si consiglia l’esame urine ogni 8-12 settimane per verificare l’eventuale comparsa di infezioni del tratto urinario per i cani che assumono cortisone. Valutare inoltre tutti gli altri possibili effetti secondari (alterazioni cutanee, polipnea, problemi gastroenterici, insorgenza di diabete, ecc.). Per i cani che assumo azatioprina, si consiglia un profilo ematobiochimico ogni 2 settimane: la mielosoppressione e l’epatotossicità possono essere infatti gravi. Per la ciclosporina, gli effetti principali sono i problemi gastroenterici e l’iperplasia gengivale. La somministrazione di ciclosporina congelata o con il cibo, riduce gli effetti gastroenterici. Per il micofenolato, si valutino gli effetti gastroenterici e si monitori l’emogramma ogni 2-3 settimane. La presenza di problemi enterici è solitamente dose-dipendente e migliora con la riduzione del dosaggio.

In caso di mielosoppressione, il farmaco responsabile deve essere immediatamente sospeso.

5) Gestione delle recidive: si riportano fino al 15% di possibilità di recidiva. Questa può avvenire durante la terapia di mantenimento: la dose dei farmaci deve essere rialzata e/o nuovi immuno-soppressori introdotti. È importante escludere fattori scatenanti secondari (come già visto per l’approccio diagnostico), quali trattamenti immunizzanti, farmaci, infezioni, neoplasie. In casi refrattari può essere consigliabile la splenectomia, ma l’evidenza scientifica è debole a riguardo.

6) Farmaci antitrombotici: tutti i cani con AEIM dovrebbero ricevere tali trattamenti preventivi, ad eccezione di quelli gravemente trombocitopenici (<30.000 PLT/uL). Esiste infatti una forte evidenza scientifica che la mortalità è dipendente da trombosi/DIC in corso di AEIM. La terapia andrebbe iniziata alla diagnosi e continuata fino alla sospensione di tutti i trattamenti cortisonici, sebbene sia più importante nelle prime 2 settimane di trattamento a dosaggio pieno. I farmaci anticoagulanti devono essere preferiti a quelli antiaggreganti piastrinici. La prima scelta cade quindi sulle eparine. Come seconda scelta il clopidogrel e l’aspirina. Nell›immagine seguente uno schema delle eparine consigliate:

Altre raccomandazioni più specifiche sono riportate nell’articolo originale, che vi alleghiamo in PDF, che contiene inoltre alcuni algoritmi e tabelle molto utili.

https://www.mylavblog.net/attachments/article/Swann%20et%20al%20JVIM%202019%2033%201141-1172.pdf

Walter Bertazzolo, Direttore Scientifico di MYLAV

AGGIORNAMENTI TERAPEUTICI SUL MORBO DI ADDISON

Ci capita spesso di ricevere richieste di consulenza sul morbo di Addison. La conferma diagnostica di questa malattia è relativamente semplice, basandosi sul test di stimolazione con ACTH. Più complessa può essere invece la gestione terapeutica, sia in emergenza, che nel lungo termine.

Introduzione

L’ipoadrenocorticismo o Morbo di Addison è una sindrome conseguente ad una insufficiente produzione di glucocorticoidi e/o mineralcorticoidi da parte della sostanza corticale delle ghiandole surrenali. Queste due categorie di ormoni sono assolutamente indispensabili per l’organismo ed una loro carenza è potenzialmente fatale per il paziente.

Nel cane l’ipoadrenocorticismo ha una prevalenza che si aggira approssimativamente tra lo 0,06% e lo 0,28% (Kelche et al, 1998). Può essere classificato in una forma primaria (circa il 95% dei casi), causata da una distruzione di entrambe le ghiandole surrenali conseguente, nella maggior parti dei casi, ad un meccanismo autoimmune, e in una forma secondaria causata da una ridotta secrezione dell’ormone trofico specifico (ormone adrenocorticotropo o ACTH) da parte dell’ipofisi; quest’ultima è generalmente conseguente a processi neoplastici e, meno comunemente, a problemi infiammatori o traumatici (Velardo et al, 1992; Thodou et al, 1995; Platt et al, 1999).

I segni clinici in corso di ipoadrenocorticismo canino possono comparire in maniera acuta o stabilirsi in modo graduale. In quest’ultimo caso essi sono caratterizzati da un andamento “altalenante”, mentre la cosiddetta crisi addisoniana è, in genere, scatenata da un evento stressante. I sintomi più frequentemente riferiti dai proprietari di cani affetti da insufficienza surrenalica sono quelli secondari alla carenza glucocorticoidea: anoressia/disoressia, vomito, letargia/depressione, debolezza/astenia, dimagramento, diarrea e tremori; più raramente anche poliuria, polidipsia e dolore addominale e quelli secondari alla carenza mineralcorticoidea che tendono ad essere più gravi e più intensi, con una grave disidratazione che può portare fino al collasso e allo shock ipovolemico. Meno comunemente si possono osservare crisi convulsive ipoglicemiche, crampi muscolari e sanguinamenti gastroenterici.

TERAPIA

L’approccio terapeutico all’ipoadrenocorticismo varia a seconda dal fatto che il paziente si presenti in crisi surrenalica (crisi addisoniana) o con segni clinici indicativi di malattia cronica ma emodinamicamente stabile.

La crisi addisoniana è una condizione pericolosa che richiede un trattamento immediato poiché un ritardo sulle misure terapeutiche, ad esempio in attesa dei risultati di laboratorio, può risultare fatale per il paziente.

Gli obiettivi della terapia d’urgenza sono la correzione dell’ipotensione, dell’ipovolemia, degli squilibri elettrolitici (in particolare il trattamento dell’iperkaliemia), dell’acidosi metabolica, dell’ipoglicemia e, quando presente, dell’anemia. Pertanto, i punti salienti della terapia consistono nella scelta di una adeguata fluidoterapia, in una corretta integrazione ormonale, nella gestione dell’iperkaliemia e delle terapie di supporto.

Per quanto riguarda la terapia cronica dell’ipoadrenocorticismo primario, questa si basa su una corretta integrazione ormonale fornita sia dalla componente glucocorticoidea che mineralcorticoidea nel caso della forma tipica (carenza di entrambe le componenti), solo della componente glucocorticoidea nel caso della forma atipica (carenza della componente glucocorticoidea).

Fluidoterapia

La fluidoterapia costituisce il punto cruciale della terapia della crisi addisoniana poiché́ il trattamento dello shock è prioritario in questi soggetti.

La scelta di una fluidoterapia idonea alle esigenze del paziente riesce, generalmente, a correggere in parte le alterazioni elettrolitiche che ne mettono a rischio la vita.

È opportuno applicare un catetere endovenoso a livello della vena giugulare o cefalica. Prima di procedere alla somministrazione di qualsiasi farmaco o fluido, andrebbe raccolto un campione di urine ed eseguito un prelievo venoso per le determinazioni ematobiochimiche di base e per la misurazione del cortisolo basale.

A questo punto si procede all’inoculazione di ormone adrenocorticotropo (ACTH, alla dose di 5 μg/kg fino ad un massimo di 250 μg per via endovenosa) per testare la risposta surrenalica e contemporaneamente si inizia la fluidoterapia.

La soluzione fisiologica (cloruro di sodio allo 0,9%) rappresenta il fluido di scelta in questa fase della patologia. Tale cristalloide, infatti, oltre a correggere ipovolemia ed ipotensione, contrasta l’iponatremia e l’ipocloremia (fornendo sodio e cloro), riduce inoltre l’iperkaliemia sia per semplice diluizione (poiché non contiene potassio), sia migliorando la perfusione renale e la filtrazione glomerulare (più potassio viene così escreto dai reni).

Possibili svantaggi conseguenti all’utilizzo di questo fluido sono il suo potenziale effetto acidificante e il rischio di indurre un troppo rapido incremento della natremia. Infatti, in corso di iponatriemia protratta, l’encefalo mette in atto dei meccanismi di adattamento per prevenire l’edema cerebrale. La rapida somministrazione di sodio in un cane affetto da iponatremia cronica causa un grave stress osmotico per le cellule cerebrali, incapaci di reagire alla nuova situazione proprio per via dei meccanismi adattativi che hanno messo in atto; il danno così arrecato al tessuto cerebrale si rende evidente tramite possibili segni neurologici (O’Brien et al, 1994; Brady et al, 1999).

Vanno quindi monitorati attentamente i livelli di sodio durante la terapia della crisi addisoniana, limitando la sua crescita ad un massimo di 10-12 mEq/L/giorno evitando l’utilizzo di soluzioni saline ipertoniche (Churcher et al, 1999).

Nei pazienti ipotesi e anche ipoprotidemici può essere preso anche in considerazione l’utilizzo di colloidi da somministrare in bolo alla dose di 5 ml/kg in 30 minuti. Nella fase iniziale della terapia, lo shock va trattato con l’infusione di soluzione fisiologia in boli da 20-30 ml/kg in 20 minuti fino a quando il paziente non risulta emodinamicamente stabile (fino a 60-90 ml/kg/h nelle prime 1-2 ore) (Boysen, 2008).

Una volta che il paziente si presenta stabile e l’ipovolemia si è risolta (frequenza cardiaca nella norma, pressione sanguigna sistemica 90-100 mmHg, lattati ematici diminuiti del 50% o normalizzati e miglioramento dello stato del sensorio), si può passare a una fluidoterapia che tenga conto del fabbisogno di mantenimento, della percentuale di disidratazione e delle perdite conseguenti a vomito/diarrea e alla poliuria/polidipsia (molto importanti da monitorare, eventualmente tramite cateterismo urinario, soprattutto per assicurarsi che non vi sia un danno renale con conseguente oliguria o anuria). In genere il dosaggio che si ottiene considerando queste variabili è di 90-120 ml/kg/giorno (3,75-5 ml/kg/ora).

La soluzione fisiologica può essere sostituita con soluzione di Ringer nel momento in cui le concentrazioni elettrolitiche sieriche siano tornate nei range fisiologici (solitamente dopo 12-24 ore di terapia).

Infine, se si sospetta o si è certi di una condizione di ipoglicemia, è opportuno integrare alla fluidoterapia del destrosio al 50%, in modo da ottenere una soluzione che abbia una concentrazione finale di destrosio pari al 5%.

Supplementazione ormonale

Non appena prelevato il campione ematico necessario per rilevare la cortisolemia post-stimolazione con ACTH, si può intraprendere la terapia glucocorticoidea e mineralcorticoidea.

È di grande importanza tenere presente che le dosi di corticosteroidi generalmente raccomandate devono essere da 3 a 10 volte superiori rispetto a quelle fisiologiche o anche maggiori in pazienti emodinamicamente instabili.

Una buona scelta iniziale può essere il desametasone somministrato per via endovenosa ad un dosaggio di 0,5-2 mg/kg, ripetuto ogni 2-6 ore al dosaggio di 0,05-0,1 mg/kg. Un importante vantaggio di questo farmaco consiste nel fatto che, a differenza degli altri glicocorticoidi, non cross-reagisce con la metodica per la determinazione del cortisolo, e può quindi essere somministrato al paziente immediatamente, anche prima dell’esecuzione del test di stimolazione con ACTH (Kemppainen et al, 1989).

Il desamentasone, inoltre, nonostante vada a diminuire la produzione di cortisolo in risposta alla somministrazione di ACTH fino al 35% in meno per 1-3 giorni a seconda del dosaggio somministrato, permette comunque di distinguere i risultati del test di stimolazione di cani con patologie non surrenaliche da cani affetti da ipoadrenocorticismo (Kemppainen et al, 1989).

Le alternative al desametasone sono il prednisolone sodio succinato EV alla dose di 1-2 mg/kg e ripetuto ogni 6 ore alla dose di 0,5 mg/kg, l’idrocortisone emisuccinato o fosfato EV alla dose di 5 mg/kg e ripetuto ogni 6 ore alla dose di 1 mg/kg oppure in infusione continua alla dose di 0,625 mg/kg/ora.

L’idrocortisone emisuccinato ha il vantaggio di possedere attività mineralcorticoidea e può diminuire la quantità di fluidi necessari per la rianimazione (Gunn et al, 2016).

Gli autori del presente articolo solitamente prediligono l’infusione continua con idrocortisone. È opportuno continuare con questo protocollo fino a quando non sia possibile passare all’integrazione di glucocorticoidi per via orale.

La terapia con mineralcorticoidi si rende necessaria per mantenere l’equilibrio elettrolitico dell’organismo; l’integrazione va presa in considerazione in pazienti in shock non responsivi alla fluidoterapia anche prima di avere confermato la diagnosi.

Uno dei farmaci più utilizzati per la sua estrema efficacia e l’unico il cui uso è consentito in ambito veterinario, è il desossicorticosterone pivalato (DOCP) (Zycortal ®), un ormone mineralcorticoide puro, che diversamente dagli altri mineralcorticoidi ha un’attività glucocorticoidea molto limitata.

Il dosaggio di partenza suggerito dalla casa farmaceutica è pari a 2,2 mg/kg per via sottocutanea. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato come dosaggi di partenza più bassi (1,5 mg/kg per via sottocutanea) siano sufficienti per un ottimo controllo della patologia (Sieber-Rucksthul et al, 2019). Un importante vantaggio del DOCP consiste nel fatto che non determina l’insorgenza di effetti collaterali, anche se somministrato a cani in cui non venga confermata la diagnosi di ipoadrenocorticismo (Chow et al, 1993; Kaplan e Peterson, 1995).

Un’alternativa al DOCP, in corso di terapia per crisi addisoniana, è rappresentata dall’idrocortisone emisuccinato, un farmaco che possiede sia attività glicocorticoide che mineralcorticoide e che risulta molto affidabile nel trattamento dell’ipoadrenocorticismo umano.

Va, infine, ricordato il fludrocortisone acetato (Florinef®), che tuttavia raramente viene utilizzato nelle crisi surrenaliche acute, in quanto è disponibile solamente in compresse.

Terapia aggiuntiva

Nella maggior parte dei casi le alterazioni elettrolitiche si risolvono con la sola somministrazione di fluidi. Nei rari casi in cui la soluzione fisiologica non sia sufficiente ad abbassare rapidamente i livelli di potassio in circolo e il paziente sia sintomatico (bradicardia, assenza dell’onda P o prolungamento dell’intervallo P-R all’ECG), può essere necessario intervenire con altre strategie.

Per proteggere il miocardio dalla condizione di iperkaliemia si può prendere in considerazione l’infusione endovenosa di gluconato di calcio al 10 % (0,5-1 ml/kg o 2-10 ml/cane in 10-20 minuti), avendo però l’accortezza di monitorare continuamente l’ECG durante l’infusione e sospendendola immediatamente nel caso in cui insorgano aritmie. Questo tipo di trattamento non ha alcun effetto diretto sulla kaliemia ma si limita a contrastare temporaneamente (circa 30 minuti) gli effetti pericolosi che questa esercita sulla funzionalità miocardica (Schaer, 2001; Feldman e Nelson, 2004; Tag e Day, 2008)

Diversamente, per abbassare le concentrazioni di potassio, si può ricorrere alla somministrazione EV di glucosio (1-2 grammi per unità di insulina) e insulina (0,2 U/kg) in infusione continua.

Figura 1 Trattamento di emergenza della crisi addisoniana

Favorire l’ingresso del glucosio nelle cellule determina il passaggio degli ioni potassio dal compartimento vascolare a quello intracellulare, con conseguente abbassamento della kaliemia. In alternativa è possibile anche effettuare un’inoculazione intramuscolare o endovenosa di insulina regolare alla dose di 0,06-0,125 U/kg associata alla contemporanea somministrazione di 20 ml di soluzione glucosata al 10% per ogni unità di insulina.

Nei casi in cui l’iperkaliemia e l’acidosi non migliorino con la semplice fluidoterapia può essere presa in considerazione anche la somministrazione di bicarbonato di sodio in quanto l’innalzamento del pH promuove l’ingresso del potassio all’interno delle cellule. Questi vanno infusi per via endovenosa in quantità pari a circa il 25-50% del deficit calcolato in un periodo di 6 ore.

Altre terapie di supporto sono rappresentate da eventuali trasfusioni con emocomponenti nei pazienti con grave anemia secondaria a sanguinamenti gastroenterici, gastroprotettori (sucralfato, anti-H2, inibitori della pompa protonica), antiemetici (maropitant, metoclopramide, ondansetron) e antibiotici in pazienti con vomito, diarrea, ulcere del tratto gastroenterico o ileo paralitico (Scott- Moncrieff, 2015).

TERAPIA DI MANTENIMENTO

Mineralcorticoidi

Il farmaco di prima scelta per la supplementazione mineralcorticoidea in corso di ipoadrenocorticismo primario è il desossicorticosterone pivalato (DOCP) (Zycortal®). Come seconda scelta, è possibile utilizzare il fludrocortisone acetato (Florinef®). I soggetti che presentano elettroliti normali al momento della diagnosi (ipoadrenocorticismo primario atipico) non richiedono la supplementazione mineralcorticoidea ma devono essere sottoposti a un monitoraggio seriale degli elettroliti per controllare l’eventuale sviluppo di alterazioni elettrolitiche e la necessità dell’integrazione mineralcorticoidea.

Il DOCP, un ormone mineralcorticoide puro che, diversamente dagli altri mineralcorticoidi, ha un’attività glucocorticoidea molto limitata, è il farmaco di scelta per la terapia del Morbo di Addison nel cane. Si tratta di un estere insolubile del desossicorticosterone, formulato in sospensione microcristallina da somministrare per via sottocutanea o intramuscolare (Lynn e Feldman, 1991; McCabe et al, 1995), efficace dopo poche ore dall’inoculazione ed avente lunga durata di azione (circa 25-30 giorni).

Fino a poco tempo fa questo farmaco non era reperibile in Italia ed era necessario importarlo dall’estero (Percorten-V® Novartis Animal Health US, Greensboro, North Carolina) a prezzi proibitivi per un proprietario.

Dal 2015 è in commercio in Italia con il nome di Zycortal®, (Dechra Veterinary Products) a un costo decisamente più accessibile. Tale farmaco è attualmente l’unico mineralocorticoide registrato per il trattamento del Morbo di Addison nel cane.

Essendo prodotto da una casa farmaceutica differente, Zycortal® differisce leggermente dal Percorten-V; in particolare, fra gli eccipienti vi è il clorocresolo al posto del thimrosal e per quanto riguarda il surfattante vi è il polisorbato 60 al posto di polisorbato 80.

Negli studi farmacologici effettuati, Zycortal® si è dimostrato sovrapponibile a Percorten-V® e per questo motivo il dosaggio di partenza suggerito dalla casa farmaceutica è rimasto lo stesso, prevedendo la somministrazione di 2,2 mg/kg per via sottocutanea ogni 25 giorni circa (Melian e Peterson, 1996).

Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato come dosaggi di partenza più bassi (1,5 mg/kg) siano solitamente sufficienti per un ottimo controllo della patologia (Bates e Schall, 2013; Sieber-Rucksthul et al, 2018).

Esiste un unico studio pubblicato che abbia valutato l’intervallo di tempo tra una somministrazione e l’altra di DOCP ed è stato condotto su soggetti trattati con Percorten-V (Jaffey et al, 2017) e non con Zycortal®. È possibile, infatti, che molti soggetti risultino ben controllati anche con un intervallo di somministrazione leggermente maggiore rispetto ai 25-30 giorni raccomandati. Nonostante ciò, non essendoci, ad oggi, studi pubblicati a questo proposito sullo Zycortal®, la raccomandazione è di non eccedere i 30 giorni di tempo tra una somministrazione e l’altra. Si tratta di un intervallo di tempo che permette di ridurre il costo del farmaco ed è facile da ricordare sia per il proprietario che per il veterinario. Essendo il DOCP un mineralocorticoide, la componente glicocorticoidea va fornita attraverso la supplementazione quotidiana di prednisolone/prednisone a 0,1-0,25 mg/kg SID PO.

È importante monitorare il cane che intraprende una terapia a base di DOCP eseguendo la prima valutazione degli elettroliti a 10-15 giorni e la seconda a 25-30 giorni dalla somministrazione del farmaco per i primi 1-2 mesi, fino al raggiungimento del dosaggio e dell’intervallo di somministrazione corretti. Il controllo a 10-15 giorni (picco di attività del farmaco) ha la finalità di valutare se sono necessari adeguamenti del dosaggio, mentre il controllo a 25-30 giorni serve a modificare l’intervallo di somministrazione. È opinione degli autori che nel monitoraggio terapeutico, piuttosto di utilizzare il rapporto Na/K, sia meglio valutare singolarmente le concentrazioni dei due elettroliti.

Molti cani richiedono un dosaggio più basso rispetto alla dose di partenza raccomandata (Kintzer e Peterson, 1997; Bates et al, 2013, Sieber-Ruckshul et al, 2018).

Una volta individuata la posologia ad hoc per il singolo soggetto, si può istruire il proprietario a somministrare egli stesso il farmaco (risospensione del farmaco, aspirazione e inoculazione), ma sono comunque consigliati controlli semestrali in quanto la richiesta dell’organismo potrebbe modificarsi nel tempo (anche in funzione a variazioni del peso corporeo).

I cani trattati con DOCP possono sviluppare poliuria/polidipsia, che si accentua ancora di più nella settimana subito successiva alla somministrazione. Ciò può verificarsi conseguentemente ad una eccessiva supplementazione con glucocorticoidi o perché il dosaggio di DOCP è maggiore rispetto al fabbisogno. In questo caso è opportuno prima provare a ridurre l’integrazione glucocorticoidea e in secondo luogo ridurre la dose di DOCP fino a quando la poliuria/polidipsia non sia risolta.

Il fludrocortisone acetato (nome commerciale Florinef®) è un mineralcorticoide sintetico che, a differenza del DOCP, possiede anche una attività glucocorticoidea intrinseca. Rispetto al DOCP ha una efficacia inferiore nel controllo degli elettroliti (Baumstark et al, 2014). Il Florinef®, disponibile sotto forma di compresse da 0,1 mg, non è presente in commercio in Italia; è però presente nella Repubblica di San Marino e in Svizzera. Il dosaggio iniziale è di 0,015-0,020 mg/kg/giorno (0,02 mg/kg), somministrato in dose singola o diviso in due somministrazioni giornaliere Anche in questo caso, come per il DOCP, l’efficacia terapeutica viene valutata sulla base della concentrazione elettrolitica. Modifiche di dosaggio di 0,05-0,1 mg/giorno devono essere effettuate sulla base della presenza di alterazioni elettrolitiche.

Gli elettroliti devono essere controllati, inizialmente, ogni settimana fino alla stabilizzazione all’interno dei range di riferimento. Una volta normalizzati gli elettroliti vanno monitorati mensilmente per i primi 3-6 mesi e successivamente ogni 3-6 mesi. In molti cani in terapia con fludrocortisone, il dosaggio giornaliero del farmaco richiesto per mantenere gli elettroliti nei range aumenta nei primi 6-12 mesi fino a una dose pari a 0,02-0,03 mg/kg/giorno (Meliàn e Peterson, 1996; Kintzer e Peterson, 1997).

Questo probabilmente succede perché si aggrava la distruzione corticale e/o per un’alterazione dell’assorbimento o del metabolismo del farmaco (Kintzer e Peterson, 1997). Il principale svantaggio di questo farmaco è conseguente alla sua attività glucocorticoidea. Può quindi succedere, e purtroppo non così infrequentemente, che con il dosaggio necessario per ottenere un normale equilibrio elettrolitico si manifestino sintomi dovuti ad un eccesso di glucocorticoidi (poliuria, polidipsia, polifagia, perdita di peso). In questi casi è necessario sospendere eventuali glucocorticoidi aggiuntivi e, se la sintomatologia non regredisce, è opportuno sostituire il fludrocortisone con il DOCP, dotato di soli effetti mineralcorticoidei. Alcuni cani in terapia con fludrocortisone possono sviluppare ipercolesterolemia, ipertrigliceridemia e iperglicemia come conseguenza di un ipercortisolismo iatrogeno e che solitamente si risolvono una volta passati al DOCP. Il fludrocortisone acetato può, inoltre, essere molto costoso, soprattutto in cani di grossa taglia; per questo motivo il DOCP può essere la scelta migliore anche in termini economici. Nell’uomo il monitoraggio della terapia avviene valutando la renina plasmatica. Nella pratica veterinaria ciò non viene effettuato in quanto la misurazione di questo parametro è costosa e viene effettuata soltanto in determinati laboratori. Tuttavia, dai risultati di uno studio è emerso che, nei cani trattati con DOCP, le concentrazioni plasmatiche di renina fossero significativamente più basse rispetto a quelle dei cani trattati con fludrocortisone, rendendo il DOCP migliore come farmaco per la supplementazione mineralcorticoidea dei cani con ipoadrenocorticismo (Baumstarck et al, 2014).

Figura 2 Schema di monitoraggio della terapia con DOCP

Glucocorticoidi

Il farmaco di scelta per la supplementazione della componente glucocorticoidea nei cani con ipoadrenocorticismo è il prednisolone (Feldman e Nelson, 2004).

Questo è dovuto sia al basso costo che al facile controllo dei livelli ematici del farmaco. Per quanto riguarda i cani trattati con fludrocortisone, solamente il 50% circa di essi richiede una terapia glucocorticoide aggiuntiva; quest’ultima è invece quasi sempre necessaria quando la fonte di mineralcorticoidi è rappresentata dal DOCP.

Il dosaggio fisiologico richiesto di prednisolone è di 0,1-0,25 mg/kg/giorno anche in alcuni casi è sufficiente una dose di 0,05 mg/kg/giorno. In seguito alla diagnosi solitamente il paziente è dimesso con un dosaggio maggiore, pari a 0,5-1 mg/kg/giorno che dovrà essere diminuito nelle settimane successive. Le modificazioni dei dosaggi devono essere fatte sulla base dei segni clinici (vomito, diarrea, anoressia) e degli effetti collaterali (poliuria, polidipsia, polifagia e affanno).

Durante eventi stressanti quali chirurgie, traumi, malattie o episodi particolarmente agitanti/eccitanti per l’animale (fuochi d’artificio, temporali) è consigliato aumentare il dosaggio glucocorticoideo giornaliero anche di 2-10 volte per evitare di incorrere in una crisi addisoniana. Tutti i proprietari, infatti, devono essere consapevoli che qualsiasi fonte di stress pone a rischio l’animale.

Walter Bertazzolo e Federico Fracassi

Bibliografia

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GLI ESAMI DI LABORATORIO NEL MONITORAGGIO: ALCUNI CONSIGLI PRATICI

Capita spesso di commentare esami di laboratorio in pazienti in terapia e/o in follow-up, che effettuano un monitoraggio clinico per le condizioni più disparate. La valutazioni di alcuni valori di laboratorio è essenziale per il clinico al fine di poter gestire il paziente, modificare le terapie in atto, valutare la prognosi e programmare i controlli nel tempo. Tuttavia mi rendo conto, facendo il consulente, di come i clinici spesso siano all’oscuro di alcuni aspetti analitici che possono inficiare tutta la loro buona volontà nell’eseguire un corretto monitoraggio.

Le misurazioni che vengono effettuate in laboratorio infatti, anche quelle con la maggiore accuratezza possibile, non sono sempre così semplici da confrontare tra loro. Facciamo alcuni esempi pratici:

1) Un paziente con insufficienza renale cronica, a cui misuro regolarmente la creatinina

2) Un paziente con una patologia renale proteino-disperdente, a cui misuro regolarmente la proteinuria mediante il rapporto PU/CU

3) Un paziente con diabete mellito, a cui controllo frequentemente glicemia e fruttosamine

4) Un paziente con leishmaniosi, a cui controllo il titolo sierologico

Ovviamente potrei andare avanti all’infinito, perché lo facciamo tutti i giorni e per numerosissime condizioni patologiche che richiedano un minimo di controllo nel tempo.

Purtroppo non teniamo conto di un aspetto analitico che, se è ovvio per il patologo clinico, non lo è altrettanto per un clinico, internista, chirurgo, dermatologo e quant’altro. Ovvero che: qualsiasi cosa che misuriamo in laboratorio ha una variabilità analitica, che dipende dalle performance del metodo di misura. Queste performance possono essere molto differenti per via della tecnica utilizzata: per esempio misurare in spettrofotometria la creatinina o la glicemia, ha una precisione analitica superiore a quella di una metodica immuno-turbidimentrica utilizzata per altri analiti, come le proteine di fase acuta. Abbiamo sottolineato più volte come metodiche sierologiche basate su ELISA quantitativo siano più accurate, in quanto più precise ed oggettive, rispetto all’immuno-fluorescenza. Oltre a questa variabilità analitica intrinseca alla metodologia usata, esiste poi una variabilità tra metodi, kit, strumenti e quindi laboratori differenti. Ci vengono spesso sottoposti in consulenza, esami di controllo fatti con metodi completamente diversi, per es. una creatinina misurata con strumenti di chimica secca “in-clinic” e confrontata con quella misurata in laboratori commerciali differenti. Oppure, peggio ancora, una sierologia misurata con metodiche diverse in laboratori differenti. Anche in questo caso potrei farvi esempi per ore.

Ebbene, questo approccio è molto criticabile e poco scientifico, perché non tiene conto della variabilità analitica, che per alcuni test di laboratorio può essere molto pesante e condizionare di conseguenza le vostre scelte cliniche.

Per cui, se posso dare un consiglio spassionato, quando dovete effettuare un monitoraggio nel tempo, assicuratevi che la metodica scelta sia sempre la stessa ed effettuata sempre nel vostro laboratorio di fiducia, che possa garantirvi inoltre degli standard di qualità elevati.

Walter Bertazzolo, Direttore Scientifico di MYLAV

LA VALUTAZIONE QUALITATIVA DELLA PROTEINURIA CON SDS-AGE NEL PAZIENTE NEFROPATICO CRONICO

L’analisi della proteinuria attraverso la misurazione del rapporto PU/CU è un ottimo strumento per quantificare le proteine totali urinarie ma non fornisce informazioni sul tipo di proteine presenti. Valutare le componenti proteiche che, caso per caso, sono responsabili dell’aumento quantitativo della proteinuria è uno step complementare alla valutazione con PU/CU ed è di aiuto nell’identificazione delle parti del rene e del nefrone maggiormente compromessi e nella stima della gravità del danno renale.

Il metodo di laboratorio più diffuso e utile a questo scopo è l’elettroforesi su gel di agar (agar gel electrophoresis, AGE). Con questa metodica le proteine urinarie sono pretrattate con SDS (Sodio Dodecil Solfato) e fatte migrare attraverso il gel. Vengono quindi separate progressivamente solo in base al loro peso molecolare e, dopo specifica colorazione, sono visibili come bande colorate sul gel.

Come si vede nell’immagine sottostante, le bande dei singoli campioni (le prime quattro strisciate partendo da sinistra) vengono confrontate con un marker di peso molecolare (le bande ben definite sulla destra) che serve per capire quale siano le dimensioni delle varie proteine nei campioni analizzati.

È così possibile classificare la proteinuria come glomerulare, tubulare o mista.

La presenza di albumina e di bande di alto peso molecolare (ossia di proteine di peso superiore all’albumina, equivalente a circa 68 kDa) è indicativa, in un soggetto proteinurico, di danno glomerulare.

Più grave è il danno glomerulare, maggiore sarà il peso molecolare delle proteine perse e delle bande elettroforetiche corrispondenti. In diversi studi condotti su cani con patologie renali di diversa natura, la sensibilità dell’SDS-AGE per l’identificazione di danni glomerulari, anche quando confrontata con l’istopatologia, è risultata essere molto elevata (da 94 a 100%).

Ciò conferma come l’SDS-AGE sia un valido test di screening per il danno glomerulare, soprattutto nei cani con proteinuria borderline (PU/CU compreso tra 0.2 e 0.5). Al contrario, la specificità risulta essere bassa (da 40% a 74%) e ciò è in parte dovuto alla presenza, sia nel cane che nel gatto, di proteine di peso molecolare superiore all’albumina che sono normalmente presenti nelle urine: le principali sono l’uromodulina (una proteina ad azione prevalentemente protettiva del tratto urinario) e la cauxina (un enzima responsabile della produzione di feromoni urinari).

Proprio per la fisiologica presenza di queste proteine nelle urine e per la possibile minima presenza di albumina nei soggetti non nefropatici, è importante fare attenzione a non interpretare come glomerulopatici i soggetti non proteinurici (falsi positivi) e, pertanto, è consigliato restringere l’utilizzo dell’SDS-AGE nei pazienti con PU/CU >0.2.

Inoltre, quando la situazione clinica lo richiede e lo permette, è sempre buona norma confermare i risultati di laboratorio con l’esame bioptico del parenchima renale poiché solo il patologo sarà in grado di caratterizzare il tipo di malattia (es.: glomerulonefrite vs glomerulosclerosi/amiloidosi). Le metodiche elettroforetiche urinarie, quindi, non rappresentano un sostituito all’esame istopatologico, ma solo un aiuto per il clinico.

La presenza di bande di basso peso molecolare (peso inferiore al peso dell’albumina) suggerisce la presenza di danno tubulare. Anche in questo caso, è stata descritta una sensibilità dell’SDS-AGE elevata nell’identificare il danno tubulare.

Nel cane nefropatico cronico, l’elettroforesi delle proteine urinarie può essere utile anche per stimare la gravità del danno tubulare: in caso di presenza di bande elettroforetiche corrispondenti a proteine con peso molecolare molto basso (nell’ordine dei 12-15 kDa) o in caso di presenza di bande tubulari più intense e/o numerose, il danno tubulare è più grave.

Nel gatto, recentemente è stata descritta l’associazione tra la presenza di bande tubulari e la nefropatia cronica, coerentemente con il carattere prevalentemente tubulo-interstiziale della nefropatia cronica idiopatica felina.

Inoltre, tale associazione può essere considerata valida non solo nei pazienti con proteinuria conclamata, ma anche nei soggetti con proteinuria borderline (PU/CU compreso tra 0.2 e 0.4). Perciò, utilizzando la metodica SDS-AGE, l’identificazione di bande tubulari in gatti con proteinuria persistentemente borderline, può supportare la diagnosi di proteinuria di origine renale in una fase precedente alla proteinuria conclamata (PU/CU >0.4) e, di conseguenza, potrebbe supportare il trattamento antiproteinurico.

Nonostante sia nel cane che nel gatto con nefropatia cronica, i pattern semplici glomerulare o tubolare possano essere rilevati, soprattutto nelle fasi iniziali della nefropatia, il pattern più frequentemente riscontrato in animali con significativa proteinuria (es.: PU/CU >2) è quello misto tubulare-glomerulare, a conferma del fatto che in corso di danno renale sia la componente glomerulare che quella tubulare vengono contemporaneamente e reciprocamente coinvolte. È evidente nell’esempio nella figura, nei campioni 1 e 3 da sinistra. In questi casi in cui il PU/CU risulta evidentemente elevato (>2-3), l’utilità dell’elettroforesi delle proteine urinarie è pertanto ridotta, poiché in questi casi vi è quasi sempre un coinvolgimento globale del nefrone e l’SDS-AGE non aggiungerebbe molte informazioni cliniche utili ala sola misurazione del PU/CU.

Marco Giraldi, Staff di MYLAV

QUANDO LA TERAPIA VI IMPEDISCE LA DIAGNOSI

Nelle nostre consulenze, ci capita spesso di commentare casi clinici nei quali alcuni esami diagnostici sono stati eseguiti dopo una terapia. Purtroppo, in molti casi, quest’ultima può rendere gli esiti delle indagini del tutto incomprensibili ed inutili. Vi faccio solo alcuni rapidi esempi:

1) Avete un sospetto di linfoma ma nel frattempo avete somministrato cortisonici al paziente: se cercherete di fare delle citologie dagli organi colpiti, è molto probabile ottenere dei campioni non diagnostici, in quanto le cellule linfomatose sono molto sensibili a questi farmaci, che sono a tutti gli effetti dei deboli chemioterapici. Il risultato sarà probabilmente un campione contenente cellule litiche non riconoscibili (vedi immagine a fianco). Sarete costretti a sospendere la terapia, aspettare giorni preziosi e dover poi ripetere il campionamento.

2) Avete un sospetto di Addison, ma anche in questo caso, durante le terapie di emergenza, avete somministrato cortisonici. Anche in questo caso, se non avete avuto l’accortezza di usare il desametazione come farmaco di emergenza, fare un test di stimolazione con ACTH può diventare un problema. Infatti qualsiasi cortisonico (ad eccezione del desametasone) viene misurato come se fosse cortisolo all’esame ormonale, e vi darebbe quindi dei risultati falsamente aumentati. Non solo. Se la terapia cortisonica è stata effettuata per parecchi giorni, diventa poi difficilissimo distinguere un vero Addison da una atrofia corticosurrenalica indotta dallo stesso cortisone. Dovrete sospendere la somministrazione di cortisonici per tempi non ben stabiliti (alcune settimane), e riprovare a fare il test, con rischi non indifferenti per il paziente, nel caso in cui avesse davvero un Addison.

3) Avete un animale azotemico, disidratato, avete fatto tutti gli esami del sangue ma avete iniziato una fluido-terapia prima di raccogliere le urine. Anche in questo caso può diventare più complicato stabilire l’origine dell’azotemia, in quanto l’esame delle urine viene inficiato dai fluidi somministrati.

4) Avete un paziente con presunti problemi emostatici/coagulativi ma avete somministrato subito la vitamina K prima di eseguire un prelievo per un profilo coagulativo. Anche qui, se il paziente era effettivamente avvelenato con rodenticidi, fare la diagnosi diventa complicato perché la vitamina K fa rientrare rapidamente i tempi di coagulazione, anche dopo la prima somministrazione. Confermare il vostro sospetto a questo punto è davvero difficile, perché dovrete prendervi il rischio di sospendere la terapia e controllare molto strettamente se la coagulazione si scompensa nuovamente.

Potrei fare numerosi altri esempi come questi. In generale, quando siamo di fronte ad un dilemma diagnostico, dobbiamo imparare sempre a chiederci: prima di fare le terapie del caso, ho raccolto tutti i dati necessari per la diagnosi? Le terapie che sto iniziando, mi potranno inficiare l’iter diagnostico?

Walter Bertazzolo, Direttore Scientifico di MYLAV

IL SIGNIFICATO DELL’EMOFAGOCITOSI IN CITOLOGIA

Per emofagocitosi o emofagia, in ambito citologico si intende il riscontro di cellule ematiche fagocitate all’interno di istiociti/macrofagi, o più raramente di granulociti neutrofili. La fagocitosi dei neutrofili da parte dei macrofagi, è ad esempio un rilievo molto comune nei focolai di infiammazione o nelle raccolte liquide infiammatorie, nelle quelli i macrofagi fungono da “spazzini” eliminando le cellule degenerate o in apoptosi.

In condizioni fisiologiche, la fagocitosi di eritrociti che si osserva negli organi emocateretici (nella milza in primis) o nelle raccolte emorragiche, è una condizione normale dovuta alla senescenza degli eritrociti stessi, che devono essere rimossi dal circolo o dalla raccolta, e il cui contenuto (in particolare il ferro e le proteine) devono essere recuperati (Figura 1).

Per un meccanismo simile, può capitare di osservare emofagia nei campioni di sangue o versamenti lasciati invecchiare per troppe ore nella provetta prima della processazione.

In alcune situazioni patologiche auto-immuni, si può osservare in diversi organi (milza, fegato e midollo osseo in particolare), una aumento dei fenomeni di emofagia, in particolare di eritrociti maturi, precursori eritroidi o più raramente di leucociti e piastrine (Figura 2). Questi rilievi sono riferibili alla distruzione immuno-mediata delle cellule ematiche circolanti e/o dei loro precursori midollari, in grado di indurre anemie rigenerative o non rigenerative, leucopenie e trombocitopenie.

Infine l’emofagia è un rilievo che si osserva non raramente nelle neoplasie istiocitarie e occasionalmente in quelle linfoidi (Figura 3), nei carcinomi, nel mastocitoma felino e negli emangiosarcomi. Anche in questo caso, quando è marcata (ad esempio in alcune forme istiocitiche o linfoidi), può condurre a gravi citopenie periferiche.

Un recente studio pubblicato su Veterinary Clinical Pathology (Schaefer et al, VCP 48: 250-254, 2019), ha mostrato come nei gatti affetti da istoplasmosi, l’emofagia sia un rilievo pressoché costante. Le cause di questo fenomeno, in questa infestazione micotica, non sono note e potrebbero dipendere da una attivazione anomala dei macrofagi, in grado di condurre a citopenie periferiche. Fortunatamente questa micosi sistemica è molto rara in Europa ed è stata segnalata soprattutto in animali importati dal continente americano. Futuri studi ci diranno se l’emofagia è una esclusiva dell’istoplasmosi o è presente anche in altre micosi sistemiche.

Walter Bertazzolo, Direttore scientifico di MYLAV

ESAME DELLE URINE CON STRISCETTE: COME LO FATE ?

Quando fate un esame delle urine nella vostra struttura, immergete le striscette urinarie nel campione oppure fate gocciolare l’urina sulla striscetta? Probabilmente chiunque di noi penserebbe che sia la stessa cosa e i risultati siano sovrapponibili. Tuttavia le istruzioni riportate dai produttori di striscette urinarie indicano che debbano essere immerse nel campione.

Un recente studio pubblicato su Veterinary Clinical Pathology (Boag et al, 48: 276-281; 2019) ha cercato di dirimere la questione: è meglio il dipping (ovvero l’immersione) oppure il dripping (ovvero il gocciolamento) e ci sono differenze significative tra le due procedure?

Gli autori hanno effettuato un confronto tra i risultati dell’esame urine condotto da tre diversi operatori, i quali eseguivano sugli stessi campioni di urina le due procedure di preparazione. La successiva lettura dei risultati veniva fatta invece con uno strumento automatizzato, per evitare la variabilità umana legata alla lettura fatta “ad occhio”.

Ebbene i risultati sono stati abbastanza sorprendenti in quanto non mi sarei aspettato grosse differenze tra le due procedure. Mentre per alcuni analiti le differenze non sono risultate importanti, per altri (es. pH, sangue, glucosio, proteine) sono invece state significative. Gli autori sostengono che probabilmente la tecnica del gocciolamento non garantisce una distribuzione uniforme del campione di urina sui pad reattivi. Pertanto l’immersione è sempre da preferirsi, a meno che non si abbia un quantitativo sufficiente di urina e sia obbligatorio ricorrere al gocciolamento.

Walter Bertazzolo, Direttore Scientifico di Mylav

FLUTD: ANTIBIOTICI SI, ANTIBIOTICI NO

Con l’acronimo FLUTD (Feline Lower Urinary Tract Disease) vengono comprese malattie delle vie urinarie inferiori molto comuni nel gatto, e che si possono associare a manifestazioni cliniche caratteristiche quali disuria, pollachiuria, stranguria, ematuria e periuria (urinazione in luoghi in inappropriati). Questa sintomatologia, in particolare nei gatti maschi, può poi associarsi a ostruzione uretrale. La FLUTD è molto comune nel gatto e le cause più importanti sono la cistite idiopatica felina (FIC) e l’urolitiasi (che da sole coprono la quasi totalità dei casi), ma esistono poi altre cause meno frequenti quali ad esempio stenosi uretrali e infezioni del tratto urinario (UTI).

L’approccio diagnostico deve comprendere una valutazione anamnestica e clinica dell’animale al fine di escludere fattori predisponenti (es.: malformazioni, tipo di dieta, fattori stressanti ambientali, pregressa urolitiasi, etc.) e deve includere l’esame delle urine oltre che la diagnostica per immagini. Spesso, se la condizione clinica lo richiede, si ricorre all’esecuzione di esami ematochimici. Se il paziente presenta ostruzione uretrale deve essere gestito in emergenza.

Le urine mostrano spesso ematuria (macro e/o microscopica), proteinuria e cristalluria (in particolare da struvite o ossalato di calcio), più raramente leucocituria e batteriuria.

Il trattamento è volto alla gestione della causa sottostante e spesso (in modo differente a seconda dei casi) si cerca di agire sui fattori stressanti ambientali o gli aspetti comportamentali, si interviene aumentando l’apporto idrico e correggendo la dieta, si somministrano eventualmente antidolorifici/antinfiammatori o spasmolitici. Nei casi più gravi o in quelli con ostruzione uretrale, l’animale deve essere ospedalizzato per ricevere fluidoterapia e gestire la disostruzione delle vie urinarie a 360°.

Molti colleghi utilizzano fin da subito un trattamento antibiotico indipendentemente dalle potenziali cause sottostanti. Ma è davvero utile? È necessario in questi casi fare sempre un’urinocoltura? Probabilmente la risposta è NO! Anzi il trattamento antibiotico in molti casi può portare poi a problemi più gravi.

La frequenza di UTI nel gatto giovane con sintomatologia riferibile a FLUTD è in realtà molto bassa (circa 1% dei casi) per cui di solito gli urologi veterinari non raccomandano l’urinocoltura in prima battuta. Non è comunque sbagliato eseguire un esame batteriologico delle urine se non ci sono limitazioni economiche, ma questo esame sarebbe più indicato se sono presenti chiari fattori predisponenti quali ad esempio positività a FIV, pregresse UTI, pregressi e recenti trattamenti antibatterici, problemi urologici cronici, immunodepressione di altra natura. A maggior ragione è sconsigliato/controindicato l’utilizzo di antibiotici alla cieca.

Attualmente non è raccomandata la terapia antibatterica, nemmeno durante la permanenza in sede del catetere uretrale. La procedura deve essere eseguita in asepsi e il catetere deve essere sempre gestito con un sistema chiuso di raccolta delle urine. Con queste attenzioni, che anche noi utilizziamo nella pratica quotidiana, l’infezione (o meglio la batteriuria) si sviluppa in poco più del 10% dei casi (vedi Cooper et al., Incidence of bacteriuria at presentation and resulting from urinary catheterization in feline urethral obstruction; JVECC 2019). In un recente studio retrospettivo eseguito presso l’Ospedale veterinario universitario dell’Università di Bologna, la frequenza di infezioni nel gatto ostruito “post-disostruzione” (non trattato con antibiotico) è del 15%. Se il gatto viene trattato con antibiotico prima e durante la procedura, e durante la permanenza del catetere uretrale, si aumenta esponenzialmente il rischio che l’infezione del tratto urinario successiva sia causata da batteri resistenti alla terapia antibiotica che è stata impostata. Unica eccezione a questa regola è legata alla gravità del quadro clinico del gatto (c.d. gatto moribondo!) e/o alla chiara evidenza di infezione già presente al momento della applicazione del catetere urinario (in questo caso sarà necessaria da subito l’urinocoltura)

Sul post-cateterismo, quello che viene raccomandato attualmente (e che anche noi facciamo in Università), è valutare la clinica del paziente ed il sedimento urinario nei giorni successivi all’asportazione del catetere e, se si hanno dubbi che possa essersi verificata un’infezione catetere associata (c.d. CAUTI), in quel caso deve venir effettuato un esame batteriologico (da cistocentesi e non da campione ottenuto attraverso il catetere stesso). La sola presenza di batteri al sedimento urinario, tuttavia, soprattutto nei primi giorni dopo l’asportazione del catetere, non indica per forza che questi batteri abbiano “attecchito” nelle vie urinarie e che siano causa di infezione. L’urinocoltura e soprattutto il trattamento antibatterico in questi casi sono raccomandati solo quando siano presenti evidenti segni clinici di infezione!

L’obiettivo principale di noi veterinari deve essere sempre quello di risolvere il problema e normalizzare la minzione del paziente in modo completo e nel tempo più rapido possibile. Solo questo consentirà al gatto di guarire altrettanto in fretta e di non sviluppare infezioni o altre complicazioni.

A breve pubblicheremo le nuove Linee Guida internazionali ISCAID (International Society for Campanion Animal Infectious Diseases) sulle UTI in cui potrete trovare molte altre informazioni al riguardo.

Francesco Dondi, Consulente di MYLAV, Università di Bologna

Walter Bertazzolo, Direttore Scientifico di MYLAV

IL CALIBRO DELL’AGO INFLUENZA I RISULTATI DI UNA CITOLOGIA?

Quando dobbiamo fare una citologia da una massa o da un organo alterato, l’utilizzo della tecnica di prelievo mediante ago sottile (Fine Needle Aspiration – FNA) è sicuramente il metodo di elezione, vista la semplicità di esecuzione, la rapidità di risposta, il basso costo ed i ridotti rischi per il paziente correlati con la procedura. Spesso ci si chiede se sia meglio aspirare oppure eseguire semplicemente una infissione. Inoltre abbiamo l’imbarazzo della scelta relativa al calibro dell’ago da utilizzare.

In generale, l’aspirazione permette di raccogliere maggiore quantità di materiale, ma anche di avere una maggiore contaminazione con sangue. L’infissione garantisce spesso buona cellularità, scarsa contaminazione ematica e ottima conservazione cellulare. La sola infissione è pertanto da preferirsi ogni volta che ci si trovi di fronte a tessuti che “cedono” facilmente materiale cellulare (es. linfonodi, fegato, neoplasie ematopoietiche ed epiteliali, ecc.), mentre l’aspirazione è più indicata per le lesioni più compatte. L’esperienza in questi casi aiuta parecchio! Inoltre ripetere più volte il campionamento con metodi diversi, quando possibile, aumenta di sicuro la probabilità di avere campioni utili al citologo.

Ma quale aghi è meglio usare? Esiste un calibro migliore? E questo può influire sulla diagnosi?

Uno studio pubblicato recentemente su Veterinary Clinical Pathology (Arai et al, 48: 287-292; 2019), ha cercato di rispondere a questi quesiti, ed i risultati sono stati abbastanza prevedibili. Sono stati confrontati tra loro i risultati di campionamenti effettuati su masse superficiali e profonde mediante aghi da 22G e 25G. Gli aghi di calibro 22G conducevano ad una maggiore componente ematica. I campioni con ago più sottile, conducevano a maggiori danni cellulari. In generale, non vi era infine una differenza significativa nella cellularità e nella capacità di condurre ad una diagnosi finale.

Studi effettuati nell’uomo hanno condotto a risultati nel complesso simili. Un grosso vantaggio nell’usare aghi molto sottili, è tuttavia la minor dolorabilità rilevata dal paziente al prelievo, dato non trascurabile in medicina umana.

In sostanza, se un campionamento è fatto correttamente, il diametro dell’ago probabilmente ha scarsi effetti sulla capacità finale di fare una diagnosi corretta.

Walter Bertazzolo, Direttore Scientifico di MYLAV

FINALMENTE FORSE LA PERITONITE INFETTIVA (FIP) POTRA’ ESSERE CURATA?

Sembra un fake, con tutte le fake news da cui siamo circondati... però è stata pubblicata recentemente sulla rivista internazionale Journal of Feline Medine and Surgery, e gli autori lavorano per la prestigiosa Università della California – Davis (Pedersen et al; JFMS 2019; Vol 21: 271-281). Tra loro annoveriamo tra l’altro la più eminente autorità in fatto di FIP, il prof. Niels Pedersens, autore di innumerevoli studi a riguardo.

In sostanza gli autori hanno testato un inibitore della replicazione dell’RNA virale, il GS-441524, che precedentemente aveva dimostrato una efficacia in vitro su culture cellulari infettate con il coronavirus della FIP (FIPV), quindi su gatti sperimentalmente infettati con FIPV ad ora su gatti naturalmente affetti da FIP. In totale, 31 gatti con una diagnosi di FIP (in forma umida o secca) basata su diversi rilievi di laboratorio, ma non sempre con una diagnosi eziologica definitiva, sono stati trattati con il prodotto sperimentale anti-virale. Di questi, 5 sono stati soppressi nei primi giorni del protocollo a causa di un rapido deterioramento delle condizioni. I restanti 26 gatti hanno mostrato un rapido miglioramento delle condizioni cliniche con la scomparsa dei principali segni e sintomi dell’infezione. Di questi 26 gatti, 18 hanno completato il ciclo di trattamento, e non hanno mostrato segni di recidiva al momento della pubblicazione dello studio. Gli altri 8 hanno avuto recidive, che sono state però controllate con un aumento del dosaggio del farmaco. Un gatto è quindi deceduto per cause non legate alla FIP (insufficienza cardiaca dovuta ad una cardiomiopatia ipertrofica) e uno a causa dello sviluppo di una FIP in forma neurologica, refrattaria al trattamento.

Lo studio ha ovviamente dei limiti (ridotto numero di gatti trattati; diagnosi virale/eziologica non sempre disponibile o identificata, ma basata in molti casi su un insieme di rilievi clinici e di laboratorio; durata del follow-up; ecc.), però rappresenta finalmente una concreta speranza per il trattamento di questa infezione, che miete ogni anno migliaia di vittime nella popolazione felina di tutto il mondo.

Walter Bertazzolo, Direttore Scientifico di MYLAV

IDENTIFICAZIONE DEI MICRORGANISMI MEDIANTE MALDITOF: COS’È E COME FUNZIONA?

Nel 2013 la FDA (Food and Drug Administration), ha autorizzato l’utilizzo della tecnologia MALDI TOF per l’identificazione dei microrganismi patogeni responsabili delle infezioni: lo spettrometro di massa si è diffuso nei laboratori di microbiologia umani e solo recentemente è approdato anche in quelli veterinari.

Il laboratorio di analisi veterinarie La Vallonèa è uno tra i pochi laboratori di analisi veterinarie nel panorama italiano a possedere questa metodica innovativa (MALDI-TOF MS Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time-Of-Flight Mass Spectrometry). Cerchiamo di spiegarvi in cosa consiste e cosa comporta questa tecnologia in pratica.

Quali sono i vantaggi di questa nuova metodica?

Innanzitutto la velocità di tipizzazione del microrganismo (in pochi minuti si ha già una risposta), ma soprattutto la maggiore accuratezza della tipizzazione, che grazie a questa metodica completamente automatizzata, realizza una vera e propria “impronta digitale” del batterio/micete.

Come funziona in termini semplici questa tecnologia?

La tecnica consiste nell’assorbire la colonia d’interesse (ottenuta tramite esame colturale classico, quindi isolata in piastra dopo opportuna semina) su di una matrice, la quale all’interno del macchinario, in presenza di condizioni di vuoto, viene irradiata con un fascio laser. Il risultato è la disgregazione del campione in numerosissimi frammenti, i quali vengono accelerati da un campo elettromagnetico adiacente e migrano fino a raggiungere una membrana analizzatrice. Il tempo in cui questi frammenti raggiungono la membrana (“tempo di volo”) dipenderà dalla loro grandezza molecolare. Ecco così che l’identificazione dei microrganismi avviene tramite l’ottenimento di spettri di assorbimento, i quali vengono confrontati in un database contenente quello di innumerevoli specie già note ed identificate: si realizza così un profilo proteico caratteristico per ciascun microrganismo, proprio come nella realizzazione di un identikit o meglio ancora di un’impronta digitale. L’accuratezza con cui si raggiunge il risultato finale arriva fino al 99,9%!

Perché è così importante affidarsi ad una metodica così accurata?

Si è sempre detto che nei confronti di una infezione batterica, da un punto di vista strettamente clinico, ci interessa sapere più le sensibilità ai vari antibiotici che il nome e cognome del batterio coinvolto. Sicuramente lo scopo finale dell’antibiogramma è quello di impostare una corretta terapia, e dunque maggior riguardo si avrà nella lettura delle sensibilità agli antibiotici ma ricordiamo anche un’altra cosa fondamentale: le interpretazioni dei breakpoints di sensibilità dipendono sempre dal genere e dalla specie del batterio isolato.

Facciamo un esempio puramente indicativo: una determinata MIC espressa da un batterio Escherichia coli avrà un suo significato, ma la stessa MIC espressa da un Citrobacter koseri potrebbe averne uno completamente diverso (e perciò risultare sensibile in un caso o resistente nell’altro a seconda dell’identificazione ottenuta, pur essendo entrambi dei batteri Gram negativi).

È questo il motivo per cui è così cruciale assicurare un’identificazione corretta: è l’unico modo per avere un profilo di sensibilità agli antibiotici attendibile.

Marta Medardo, Responsabile del settore di Microbiologia di Mylav.

SI POSSONO DIFFERENZIARE LE NEOPLASIE EPATOIDI BENIGNE DA QUELLE MALIGNE CON LA CITOLOGIA?

A questa domanda hanno cercato di rispondere alcuni colleghi italiani con uno studio pubblicato recentemente sul Journal of Small Animal Practice (Sabattini et al JSAP 2019.

A questa domanda hanno cercato di rispondere alcuni colleghi italiani con uno studio pubblicato recentemente sul Journal of Small Animal Practice (Sabattini et al JSAP 2019). Le neoplasie delle ghiandole circumanali (chiamate anche epatoidi, per la somiglianza cito-morfologica delle cellule secernenti con gli epatociti) sono molto comuni nella specie canina, in particolare nei maschi. A dispetto del loro nome, queste strutture ghiandolari sono distribuite in tutta la zona perineale, sulla coda, nella zona prepuziale ed anche sul dorso.

Da un punto di vista istopatologico, le proliferazioni di questi annessi ghiandolari vengono classificate in iperplasie/adenomi, epiteliomi ed adenocarcinomi. Le iperplasie e gli adenomi mantengono le caratteristiche delle ghiandole mature, con una netta distinzione tra cellule di riserva (che hanno un aspetto basaloide) e quelle mature, tipicamente simili ai normali epatociti. Nei gruppi cellulari si nota solitamente molto bene la rima di cellule basali attorno alle cellule mature. Gli epiteliomi mostrano una prevalenza di cellule di riserva frammiste a un minor numero di cellule epatoidi mature. Negli adenocarcinomi, vi è un aumento generalizzato del rapporto nucleo/citoplasma, dissociazione tra cellule di riserva e cellule mature ed atipie citologiche più o meno marcate.

Da un punto di vista citologico, le neoplasie maligne (epiteliomi e carcinomi) incluse in questo studio, mostravano gruppi cellulari più voluminosi, con margini irregolari, mancanza di distinzione tra elementi di riserva e cellule mature, nidi solidi di cellule di riserva, dissociazione degli elementi maturi con cellule di riserva, atipie citologiche e nucleari di vario grado, differenziazione sebacea e flogosi cronica.

Gli autori dello studio hanno elaborato quindi un semplice algoritmo diagnostico che può aiutare il citologo nel determinare la benignità VS malignità della neoplasia (vedi immagine sotto, adattata dall’articolo originale).

Utilizzando questo algoritmo, gli autori sono riusciti a classificare un gruppo di 77 neoplasie circumanali (di cui 55 benigne e 22 maligne) con una accuratezza complessiva molto soddisfacente (accuratezza 87%, sensibilità 91%, specificità 85%).

Walter Bertazzolo, Direttore Scientifico di MYLAV

UN GATTO CON INFEZIONI RICORRENTI

Cari colleghi, vi presentiamo un interessante ed istruttivo caso clinico relativo ad un gatto maschio sterilizzato di 4 anni che vive in casa ma ha accesso al giardino, insieme ad altri cani e gatti.

Il paziente viene trattato regolarmente per i parassiti interni ed esterni ed è vaccinato altrettanto regolarmente per Herpesvirus, Calicivirus, Parvovirus, e FeLV.

Viene portato alla visita presso la Clinica Veterinaria Letimbro, a causa di debolezza, inappetenza ed intolleranza all’esercizio. Alla visita clinica risulta essere ipotermico e tachipnoico. L’esame emocromocitometrico dimostra marcata anemia (Ht 6,8%, Hb 2,4 g/dL) non rigenerativa. I test FIV e FeLV sono negativi. Le radiografie del torace e l’ecografia addominale non mostrano alterazioni rilevanti. Si esegue la ricerca di anticorpi antiglobuli rossi ed un profilo coagulativo, entrambi nella norma.

Viene eseguita una citologia midollare ed il quadro è indicativo di una grave ipoplasia selettiva della linea eritroide (vedi l’esempio di figura 1, nella quale si osservano esclusivamente elementi mieloidi in assenza di precursori eritroidi). Nell’ambito terapeutico e diagnostico di questo quadro, il gatto riceve dapprima trasfusioni di supporto e successivamente terapie immunosoppressive, in quanto queste alterazioni midollari riconoscono solitamente cause immuno-mediate. Si raggiunge così un ritorno alla normalità.

Dopo qualche mese, viene aggredito da un altro gatto e sviluppa una lesione ascessuale a livello della coscia sinistra, motivo per il quale torna alla visita: viene trattato con drenaggio ed enrofloxacina per 12 giorni e la ferita sembra guarire perfettamente. A distanza di qualche settimana, il gatto viene riportato in clinica poiché i proprietari riferiscono di una nuova ferita a livello di coscia destra, apparentemente in assenza di traumi o colluttazioni. Su questa seconda ferita si decide di effettuare un tampone microbiologico completo, con ricerca di germi aerobi, anaerobi e miceti.

Dopo circa 4-5 giorni dalla semina si riscontra positività stentata su terreno non selettivo (Columbia blood agar, Oxoid) e più evidente su terreno contenente acido nalidixico (CNA agar, Oxoid): si evidenzia una colonia batterica bianco-grigiastra in purezza, a margini leggermente frastagliati (vedi foto 2). Gli altri terreni rimangono negativi, compresa la semina anaerobia.

Viene eseguita l’identificazione del batterio con metodica MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight): il batterio isolato è Mycobacterium fortuitum group con affidabilità del 99,9%.

Vengono eseguiti test di sensibilità sul batterio, che rivelano una buona sensibilità a fluorochinolonici, gentamicina, e tetracicline, ed una resistenza a cefalosporine, penicilline e rifampicina. Vengono eseguiti strisci da colonia pura, per colorazioni di Ziehl-Neelsen e Fite-Faraco, che si rivelano entrambe positive, rilievo tipico per i micobatteri. (vedi foto 3)

Il micobatterio isolato appartiene al gruppo degli NTM (Non-Turberculous Mycobacterium), anche detti “micobatteri atipici”, alcuni dei quali sono caratterizzati da tempi di crescita veloci (ovvero al di sotto dei 7 giorni), a differenza della maggior parte degli altri micobatteri, che richiedono tutti ben più di 7 giorni di semina (settimane/mesi). Questo gruppo di batteri, dotati di buona resistenza nell’ambiente esterno, si ritrova nelle acque e nel terreno ed uno dei principali meccanismi di infezione è proprio la contaminazione da parte di sporcizia e terra su ferite aperte, come probabilmente è accaduto nel paziente oggetto di questo caso. La terapia immunosoppressiva, utilizzata per risolvere il problema dell’anemia, ha probabilmente favorito l’ingresso del micobatterio, favorendo così lo stabilirsi di una infezione cronica.

Ad oggi il paziente sta bene, e la ferita è nuovamente guarita dopo somministrazione di enrofloxacina a 6 mg/kg. I protocolli terapeutici prevedono una long-term therapy, per la natura dell’agente eziologico implicato e la difficile eradicazione completa, con tempi di somministrazione fino a 8-12 settimane, spesso utilizzando un’associazione di due, se non tre diversi principi attivi ai quali il batterio è risultato sensibile (fluorochinoloni + rifampicina o fluorochinoloni + doxiciclina ad esempio). Nei casi in cui le lesioni risultano circoscritte (noduli, granulomi), è indicata anche la rimozione chirurgica al fine di ottenere una completa remissione.

Ringrazio il dr. Alessandro Negro, della Clinica Veterinaria Letimbro, per aver condiviso con noi le informazioni cliniche di questo interessante caso e averci dato l’opportunità di pubblicarlo sul blog.

Marta Medardo, Responsabile del Servizio di Microbiologia di Mylav

LE GLOMERULOPATIE IMMUNO MEDIATE DEL GATTO NON SONO POI COSI’ RARE

Storicamente, le nefropatie croniche nel gatto sono state associate principalmente ad alterazioni renali riconducibili a nefrite tubulo-interstiziale cronica (NIC). In queste patologie, molto comuni nella pratica clinica, il danno tubulo-interstiziale cronico, indipendentemente dalla causa primaria, causa secondariamente alterazioni glomerulari (es. glomerulosclerosi). La gravità istologica della NIC è stato correlata precedentemente con lo stadio IRIS e con la gravità delle alterazioni di laboratorio (azotemia, ipercreatininemia, iperfosfatemia), mentre l’entità della proteinuria è risultata modesta.

Le glomerulonefriti immuno-mediate (GN) sono invece considerate poco comuni nei felini, a differenza dei cani, nei quali la diffusione di alcune patologie predisponenti (es. leishmaniosi), influisce fortemente sulla prevalenza di tali glomerulopatie. Tuttavia, la reale incidenza delle GN fino ad oggi non era chiara ed erano disponibili descrizioni di casi singoli. Infatti, per una diagnosi morfologica ed una classificazione corretta di queste patologie sono necessarie tecniche diagnostiche particolari, oltre al semplice esame istologico, quali colorazioni istochimiche speciali e microscopia elettronica a trasmissione.

Un recente studio pubblicato da colleghi italiani su BMC Veterinary Research (Rossi et al, 2019) e che ha coinvolto, in qualità di patologo di riferimento, il nostro consulente Luca Aresu, ha valutato le alterazioni strutturali tramite esame istologico e microscopia elettronica di 68 biopsie renali ricevute allo European Veterinary Renal Pathology Service (http://www.evrps.net ). Il primo dato interessante da notare era che il 54% delle biopsie mostrassero danni compatibili con GN mentre il 46% una NIC. È ovvio che questo dato va interpretato con cautela: la sovra-rappresentazione delle GN probabilmente dipende dal fatto che i nefrologi clinici sottopongono a biopsia renale proprio quei pazienti con un elevato sospetto clinico per la GN stessa: questi gatti potrebbero beneficiare della diagnosi bioptica e di una terapia specifica, mentre non sottopongono a biopsia quei pazienti con forte sospetto per una NIC, che non beneficerebbero invece di alcun vantaggio terapeutico oltre al regime stabilito dalle linee guida IRIS.

Le GN nel gatto sono state associate principalmente ad infezioni croniche (quali FIV, FeLV e FIP) ed, in effetti, nello studio di Rossi et al., la prevalenza di gatti FIV o FeLV-positivi con GN (35%) era significativamente più elevata rispetto a quello del gruppo delle NIC (0%). L’età media era comprensibilmente più bassa nelle GN rispetto alle NIC. Un riscontro molto interessante era inoltre relativo alla proteinuria: nelle GN ci si aspetterebbe un PU/CU più elevato rispetto alle NIC. In effetti questo dato è stato confermato nello studio (il valore medio era 7 nelle GN vs 2,6 nelle NIC). Ne è scaturito che un cut-off di 3,8 di PU/CU, permetteva di distinguere con una elevata accuratezza le GN (PU/CU >3,8 nel 92% di casi) rispetto alle NIC (PU/CU <3,8 nel 94 % dei casi). Non vi erano invece differenze significative relative ad altri dati clinici (es. pressione arteriosa) o di laboratorio (es. entità dell’azotemia, creatininemia, ecc.).

In conclusione, sebbene questo studio sicuramente sopravvalutava la reale prevalenza delle GN rispetto alle NIC, proprio a causa della selezione dei casi raccolti, ha permesso tuttavia di gettare nuova luce sulle GN feline. Queste patologie non vanno trascurate e devono essere sospettate soprattutto nei gatti nefropatici più giovani, con infezioni concomitanti (in particolare retrovirali) e con proteinuria marcata.

La biopsia renale, che comprenda sia istologia sia esame ultrastrutturale, in questi casi è altamente raccomandabile per una diagnosi definitiva (vedi anche nostri blog precedenti: https://www.mylav.net/blogc/view/220; https://www.mylav.net/blogc/view/187).

Luca Aresu & Walter Bertazzolo

IL CORRETTO ALLESTIMENTO DI UN CAMPIONE ISTOLOGICO – PARTE 1: FISSAZIONE

La prima fase per l’allestimento di un campione istologico è la fissazione del campione bioptico/tissutale, passaggio fondamentale per la corretta preparazione e lettura del preparato al microscopio.

La prima fase per l’allestimento di un campione istologico è la fissazione del campione bioptico/tissutale, passaggio fondamentale per la corretta preparazione e lettura del preparato al microscopio.

La fissazione consiste nel trattamento del campione di tessuto, con procedimenti chimici e/o fisici capaci di preservare la morfologia tissutale e cellulare, impedendone quindi l’autolisi, che renderebbe impossibile una interpretazione patologica.

La formaldeide è una molecola gassosa a temperatura ambiente, dall’odore pungente ed altamente solubile in acqua: la soluzione così ottenuta prende il nome di formalina. La formalina neutra tamponata al 10% rappresenta il fissativo per eccellenza poiché mantiene inalterata la morfologia cellulare e l’architettura dei tessuti, oltre a conservare in maniera soddisfacente l’antigenicità di cellule ed agenti eziologici, bloccando i fenomeni di autolisi. Linee guida nazionali (Ministero della Salute, CSS del 5/2015) raccomandano l’utilizzo di formalina tamponata per prevenire l’acidificazione causata dalla capacità dell’acido formico di ossidarsi: è necessario utilizzare formalina tamponata per evitare variazioni di PH che possono alterare le proprietà antigeniche, che renderebbero difficoltose ad esempio le procedure immuno-istochimiche. La formalina penetra nei tessuti ad una velocità di circa 1mm/h: per tale ragione, i campioni di grandi dimensioni necessitano una fissazione prolungata; inoltre è consigliabile eseguire delle incisioni parallele e non compete, che facilitino la penetrazione del fissativo. Il rapporto ottimale di formalina e campione dovrebbe essere 20:1.

Per la fissazione e la conservazione dei campioni, è necessario utilizzare quindi contenitori a bocca larga e capienti: si ricordi che dopo l’immersione in formalina il campione, fissandosi, tenderà ad irrigidirsi. L’utilizzo di contenitori dalla bocca stretta provocherebbe problemi durante la fase di estrazione del campione dal contenitore. Sono da evitare barattoli in vetro, poiché potrebbero rompersi durante il trasporto inficiando il risultato finale e mettendo a rischio la salute degli operatori.

Come già specificato, non è sufficiente diluire la formalina con acqua, soprattutto se non deionizzata. Se si volesse preparare la soluzione in casa sono necessari oltre alla formaldeide al 40%, acqua deionizzata, sodio fosfato monosodico e bisodico necessari per la conservazione del PH (7,2-7,3). Per questo è assolutamente consigliabile acquistare soluzioni di formalina al 10% neutra tamponata pronta all’uso (vedi immagine allegata). Essendo inoltre molecola volatile, tende ad evaporare facilmente, compromettendo la sicurezza dell’operatore che la sta preparando, trattandosi di un agente chimico pericoloso (irritante, caustico e cangerogeno, vedi linee guida del Ministero della Salute, CSS del 5/2015). L’utilizzo della formaldeide come fissativo, richiede quindi l’osservazione di alcune norme operative, necessarie per garantire la sicurezza di tutto il personale potenzialmente esposto.

Ad oggi non è ancora disponibile una valida alternativa alla formalina come fissativo dei campioni istologici: questa risulta quindi ancora indispensabile nei laboratori di anatomia patologica. Quello su cui si può intervenire è la riduzione dell’esposizione del personale a tale sostanza, mediante l’uso di contenitori pre-riempiti che annullano quasi totalmente l’esposizione diretta, l’utilizzo di cappe aspiranti nei laboratori di patologia e l’utilizzo di dispositivi di sicurezza individuali (es. guanti, occhiali protettivi, mascherina, camice, ecc.).

Maria Massaro & Walter Bertazzolo

NOVITA’ NELL’IPOTIROIDISMO CANINO

Recentemente sulla rivista VETERINARIA, è comparso un articolo pubblicato dal Prof. Fracassi e dai suoi collaboratori dell’Università di Bologna, intitolato “Ipotiroidismo canino: assenza di correlazione fra aspetti clinici e alterazioni clinico-patologiche” (Lunetta et al, Veterinaria 2019; 33: 171-178).

In questo studio si valutavano i segni clinici e le anomalie di laboratorio in un gruppo di 68 cani ipotiroidei.

La diagnosi definitiva veniva confermata dal rilievo di riduzione del T4 totale ed aumento del cTSH e/o da un test di stimolazione con TSH ricombinante umano (rh-TSH) compatibile (consistente in una scarso aumento dei valori di T4 dopo 6h dall’infusione endovenosa di rh-TSH).

A ciascun animale è stato assegnato uno score clinico risultante dalla somma dei vari rilievi emersi all’esame fisico. Gli animali con score clinico elevato avevano una forte indicazione clinica per questa disendrocrinia, mentre quelli con score più basso, si presentavano paucisintomatici.

Circa il 30% dei cani ipotiroidei presenta un TSH normale: si ritiene che questi cani siano in una fase più cronica della malattia e quindi potenzialmente con sintomatologia clinica più marcata.

Gli autori hanno quindi valutato se gli score clinici fossero in qualche modo correlati con le classiche alterazioni di laboratorio dell’ipotiroidismo (anemia non rigenerativa, ipercolesterolemia, aumento degli enzimi epatici, ecc.) e il profilo ormonale.

Tutti i 68 cani mostravano effettivamente una riduzione del T4 totale, mentre il TSH risultava elevato nel 72% dei cani dello studio, confermando i dati della letteratura. L’anemia era presente nel 48% dei casi, l’ipercolesterolemia nel 95%, l’ipertrigliceridemia nel 79%, l’aumento dei vari enzimi epatici in circa la metà dei cani testati. Lo score clinico, le alterazioni ematobiochimiche ed il valore del T4 totale non mostravano differenze significative tra i due gruppi (TSH elevato vs TSH normale).

In conclusione non sono emerse correlazioni significative tra i valori ormonali, lo score clinico e le alterazioni ematobiochimiche dei cani dello studio.

Pertanto le alterazioni di laboratorio, sebbene siano fondamentali per giungere alla diagnosi della disendrocrinia, non possono essere utilizzate né per valutarne la gravità clinica né sembrano in grado di poter stabilire la possibile durata nel tempo della patologia.

Federico Fracassi & Walter Bertazzolo

PRELIEVO EMATICO NEGLI UCCELLI

Abbiamo chiesto al nostro consulente in medicina degli animali non convenzionali Gustavo Picci di rispondere ad alcune domande relative al prelievo ematico nei volatili.

Quali sono i siti per effettuare il prelievo ematico negli uccelli?

Negli uccelli la scelta del sito di prelievo varia in base alla specie ed alla dimensione del paziente. Benché la vena di elezione sia la giugulare destra, altri siti da cui si possono effettuare i prelievi sono la vena brachiale o alare e la vena metatarsale mediale.

La vena giugulare destra è un vaso facilmente individuabile e di discrete dimensioni anche negli uccelli di piccola taglia. Inoltre è più grande rispetto a quella di sinistra e si visualizza bagnando le piume della regione del collo con alcool ed effettuando successivamente una leggera compressione. Questo sito è il più utilizzato nei pappagalli, ma può essere adoperato anche nei rapaci e nei galliformi.

Si possono prelevare campioni ematici di buona qualità sebbene, a causa della difficoltà di contenzione di alcuni pazienti (Ara, Cacatua, Rapaci), spesso sia necessaria la sedazione. Nei colombi si utilizza la vena brachiale in prossimità dell’articolazione omero radioulnare.

Come si effettua il prelievo dalla vena brachiale?

La vena decorre medialmente all’articolazione omeroradioulnare in posizione superficiale, per questo motivo si riesce ad evidenziare con facilità. Il paziente viene contenuto in decubito dorsale da un operatore oppure viene sedato; successivamente si bagna con alcool per evidenziare la vena, che viene approcciata in senso cranio caudale aspirando delicatamente per evitare il collasso delle pareti. Subito dopo il prelievo è necessario effettuare una compressione delicata per qualche minuto in modo tale da evitare la formazione di un ematoma. La vena brachiale si può usare anche per i pappagalli e per i rapaci, in questi ultimi con qualche cautela in quanto, a volte, la formazione dell’ematoma può limitarne il volo.

Come si effettua il prelievo dalla vena metatarsale mediale?

Rispetto alle altre vene questa si evidenzia con maggiore difficoltà perché è circondata dai muscoli della zampa e la cute in questa zona anatomica è squamosa. La vena decorre medialmente al metatarso in prossimità dell’articolazione del tarso. È il sito di prima scelta per i prelievi nei Galliformi, negli Anseriformi e in altre specie di grandi dimensioni. Nei Pappagalli non è utilizzata con frequenza a causa del metatarso corto, mentre nei Colombi è molto fragile. Si evidenzia comprimendo prossimalmente all’articolazione.

Quanto sangue possiamo prelevare?

La quantità di sangue prelevabile varia in base allo stato di salute e alla taglia del paziente. In soggetti sani è possibile prelevare fino all’1% del peso corporeo (10 ml per kg di peso). Ad esempio in un parrocchetto dal collare adulto (Psittacula krameri) di 120 grammi è possibile prelevare fino ad un massimo di 1,2 ml. In un pappagallino inseparabile (Agapornis) di 50 grammi possiamo ottenere un campione ematico di 0,5 ml.

Cosa dobbiamo inviare al laboratorio per effettuare un profilo emato-biochimico completo?

Il laboratorio effettua la lettura del quadro ematico del paziente aviare su campioni conservati in EDTA e relativo striscio, questa procedura è eseguita mediante lettura manuale. Per il profilo biochimico e l’elettroforesi sono richiesti circa 0,5 ml di siero ma abbiamo la possibilità di lavorare con microquantità.

Gustavo Picci, consulente di MYLAV

LA FIP È ANCORA UN DILEMMA DIAGNOSTICO

Ancora oggi, a dispetto della miriade di indagini disponibili in medicina felina, la diagnosi “in vivo” della peritonite infettiva felina (FIP) resta un problema. Allo stato attuale infatti, l’unico metodo certo per una diagnosi definitiva, resta l’identificazione del virus all’interno delle lesioni istologiche, ottenute mediante biopsia o alla necroscopia. Il virus può infatti venir identificato mediante tecniche immuno-istochimiche all’interno dei macrofagi (vedi immagine 1).

Numerosi studi hanno valutato l’utilità dei rilievi ematologici e biochimici, dei protidogrammi, delle proteine di fase acuta, della sierologia e della biologia molecolare, ma nessuno di questi test, presi singolarmente, può garantire una diagnosi eziologica definitiva.

Negli esami ematobiochimici si possono riscontrare rilievi comuni ma poco specifici per la FIP, quali anemia non rigenerativa, linfopenia (nelle forme effusive), iperbilirubinemia, iperproteinemia con ipoalbuminemia ed ipergammaglobulinemia, aumento delle transaminasi epatiche, aumento delle proteine di fase acuta. Molte di queste anomalie si possono riscontrare anche in altre patologie infettive, immuno-mediate e neoplastiche del gatto. Lo stesso dicasi per il tracciato elettroforetico, che si caratterizza, nella maggior parte dei casi, da un aumento marcato delle alfa-2 globuline e delle gamma-globuline (vedi immagine 2).

Figura 2 - Tipico tracciato elettroforetico di un gatto con FIP.

La sierologia può avere una utilità diagnostica, ma solo in caso di titoli molto elevati: i gatti producono infatti anticorpi che cross-reagiscono con il coronavirus enterico e quello della FIP. Dato che il primo è ampiamente diffuso nella popolazione felina, è normale aspettarsi una sieropositività anche in molti gatti sani o con patologie differenti dalla FIP.

Infine, negli ultimi anni si è cercato di sviluppare delle metodiche di biologia molecolare in grado di distinguere tra un coronavirus enterico ed un coronavirus mutato in grado di causare FIP: ad oggi purtroppo non sono disponibili test affidabili in tal senso e una positività alla PCR per coronavirus non permette quindi di confermare una FIP, anche allorché l’RNA virale venga individuato in versamenti, sangue, tessuti, ecc. Il ben più innocuo coronavirus enterico può infatti causare viremie transitorie e quindi rinvenirsi in numerosi tessuti o fluidi corporei.

Un lavoro recentemente pubblicato da colleghi italiani (Lorusso et al, Res Vet Scie, 2019; 125:421-424) ha confrontato il titolo sierologico e la carica virale mediante real-time PCR su versamenti di gatti con FIP effusive. Non è risultata alcuna correlazione tra le due misure, per cui era possibile osservare campioni con elevata carica virale e sierologica, elevata carica virale e basso/negativo titolo sierologico o viceversa bassa/negativa carica virale ed elevato titolo sierologico.

La scarsa correlazione tra questi due test può essere spiegata in diversi modi: in primo luogo, una elevata carica virale potrebbe condurre a fenomeni di neutralizzazione degli anticorpi prodotti dal gatto, rendendoli poco rilevabili ai test sierologici, possibilità già descritta in passato da altri studi (ad es. Meli et al J Feline Med Surg 2013; 15: 295-299). Nelle fasi terminali di molte malattie virali, è possibile inoltre osservare una riduzione del titolo sierologico.

Inoltre trattandosi di un virus ad RNA, è possibile cha l’assenza di carica virale in alcuni campioni sia conseguente alla denaturazione o inattivazione dell’acido nucleico virale (molto meno stabile del DNA). Questa possibilità è stata dimostrata essere molto frequente in uno studio (Addie et al J Feline Med Surg 2015; 17: 152-162), essendo presente in quasi la metà dei casi analizzati. In sostanza, concludono gli autori (Lorusso et al 2019) che non è consigliabile basarsi su un singolo esame sierologico o molecolare per la diagnosi di FIP. Andrebbero viceversa eseguiti sempre contemporaneamente, per aumentare la probabilità di ottenere un risultato significativo.

Paradossalmente, uno dei metodi più specifici per la diagnosi di FIP resta la citologia: il classico quadro che si osserva nei versamenti cavitari o nei prelievi da lesioni focali in corso di FIP secca, ha poche diagnosi differenziali e resta quindi il test con il più elevato valore predittivo positivo.

Figura 3 - Tipico aspetto di un essudato asettico da FIP.

Figura 4 - Quadro infiammatorio piogranulomatoso in un linfonodo addominale di gatto con FIP.

Walter Bertazzolo, Direttore Scientifico di MYLAV

EUCAST E LINEE GUIDA EUROPEE

Che cos’è l’EUCAST, cosa rappresenta per la microbiologia clinica e perché è importante seguire i suoi standard?

Ci capita spesso di coadiuvare i colleghi veterinari clinici nell’interpretazione degli antibiogrammi.

Spesso ci chiedono perché abbiamo testato un antibiotico piuttosto che un altro per quel microrganismo isolato? Magari preferirebbero testare antibiotici in uso nella loro struttura. E come vanno interpretatati MIC e breakpoints?

Insomma perché i nostri antibiogrammi sono così “rigidi” (o forse sarebbe meglio dire “rigorosi”). Il motivo è molto semplice: perché da anni MYLAV ha deciso di seguire le linee guida internazionali dell’EUCAST. Cerchiamo di spiegarvi di cosa si tratta.

L’EUCAST è la commissione europea che si occupa dei test di sensibilità antimicrobica (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing – www.eucast.org/), nasce nel 1997 da membri dell’ESCMID (European Society of Clinical Microbiology and Infectious Disease – www.escmid.org/) ed ha il preciso scopo di fornire breakpoints sempre aggiornati per la lettura dei test di sensibilità antimicrobica, siano essi automatizzati o manuali, da parte dei laboratori di microbiologia di tutta Europa.

La funzione cruciale di questa organizzazione è quella di fornire una standardizzazione nella lettura dei test di sensibilità antimicrobica, fornendo una rete di conoscenze redatte da esperti, che rispecchino la situazione europea a livello microbiologico. La commissione nasce nel settore della microbiologia clinica umana, e solo di recente instaura una sotto-commissione veterinaria (VetCAST).

Per ogni tipo di microrganismo, l’EUCAST individua una serie di principi attivi che devono essere testati, perché si ritiene che siano i più adatti per quella specie batterica e perché è meno probabile che possano indurre pericolosi fenomeni di resistenza. Di conseguenza ci dice indirettamente cosa sarebbe “obbligatorio” utilizzare in ambito cinico, una volta isolata quella specie batterica. In secondo luogo ci indirizza verso i principi attivi più adatti per quello specifico caso, indicandoci anche i breakpoints per le varie MIC. In questo modo, tra più antibiotici ai quali il microrganismo è sensibile, possiamo scegliere quello con la MIC più favorevole.

È perciò fondamentale che qualsiasi laboratorio europeo che si occupi di microbiologia, sia umana che veterinaria, tenga conto degli standard redatti dall’EUCAST. Solo uniformando il modus operandi si può minimizzare la progressione dell’antibiotico resistenza, ottenendo così il meglio dai test di sensibilità antimicrobici. Le linee guida EUCAST inoltre vengono revisionate e modificate nel tempo in base all’aggiornamento scientifico.

Tutto ciò interessa il veterinario clinico non solo per esser consapevole degli standard che segue il proprio laboratorio di fiducia, ma anche per avere una fonte di consultazione ufficiale per quanto riguarda l’interpretazione della MIC.

Sul sito della commissione sono infatti disponibili tutti i breakpoints relativi ai diversi generi di batteri nei confronti delle varie classi di antibiotici.

Ricordate infine di far affidamento sempre ad un veterinario microbiologo se la scelta dell’antibiotico più adatto vi risulta comunque difficoltosa e se avete questioni a riguardo.

Sul portale MYLAV delle consulenze possiamo rispondere ai vostri dubbi.

Marta Medardo, responsabile del settore di Microbiologia di MYLAV

LA TROMBOCITOPENIA IMMUNOMEDIATA DEL CANE: UN UPGRADE

La trombocitopenia immuno-mediata è una patologia ematologica molto comune nel cane, più rara nel gatto. La diagnosi presenta numerosi punti oscuri in quanto non esistono test diagnostici di conferma affidabili.

Recentemente è stata pubblicata una review sull’argomento che riassume gli aspetti patogenetici e diagnostici della trombocitopenia immunomediata canina (LeVine DN e Brooks MD. Immune thrombocytopenia (ITP): Pathophysiology update and diagnostic dilemmas. Vet Clin Pathol. 2019).

Ve ne facciamo un breve resoconto in quanto se ne evidenziano numerosi aspetti poco noti alla maggior parte dei clinici veterinari.

In sintesi, la trombocitopenia immunomediata (immune thrombocytopenia, ITP) è una patologia acquisita autoimmune caratterizzata dalla carenza di piastrine e dalla propensione a sviluppare petecchie ed emorragie potenzialmente anche letali.

Il sistema immunitario può agire con due principali meccanismi: attraverso la produzione di auto-anticorpi diretti contro le piastrine (o i megacariociti) che vengono conseguentemente fagocitate dal sistema macrofagico e/o attraverso l’azione cellulomediata dei linfociti T citotossici contro i megacariociti o megacarioblasti midollari.

La riduzione della produzione midollare ha assunto negli ultimi anni sempre maggiore attenzione, in quanto sembra avere nell’uomo, un ruolo più importante della distruzione periferica.

Gli esatti meccanismi patogenetici alla base di questa patologia non sono ancora del tutto chiariti ma, in modo simile ad altre patologie autoimmuni, è noto che nel soggetto affetto da ITP sussiste uno stato pro infiammatorio (con aumento dei linfociti T helper) e una riduzione o perdita della tolleranza agli antigeni endogeni (con riduzione e disfunzione dei linfociti T e B regolatori, i Treg e Breg). Inoltre, sembrano giocare un ruolo non secondario nella patogenesi anche l’inadeguata produzione di trombopoietina da parte degli epatociti, la presentazione al sistema immunitario di antigeni self da parte dei megacariociti (attraverso i recettori MHC I), e la predisposizione genetica (soprattutto nel Cocker spaniel e nel Bobtail, le razze che presentano una maggiore prevalenza di ITP primaria).

Dal punto di vista diagnostico, il vero problema per il veterinario clinico è la mancanza di un test gold standard. Di conseguenza la diagnosi di ITP è, ad oggi, confermata solo escludendo tutte le altre cause di trombocitopenia. Allo stesso modo, la ITP primaria è diagnosticata escludendo le cause di ITP secondaria ad altre patologie. Secondo uno studio condotto su 61 cani con trombocitopenia, la ITP primaria era la causa più frequente, presente nel 57% dei soggetti, mentre il 28% era affetto da ITP secondaria a neoplasie (circa 10%), malattie infettive (circa 10%), patologie epatiche (5%) e assunzione di farmaci (3%); il restante 15% presentava trombocitopenia non immunomediata (aplasia midollare o coagulopatia da consumo).

In prima battuta, è necessario escludere le cause non patologiche di trombocitopenia, ovvero l’aggregazione piastrinica che può avvenire durante il prelievo di sangue (escludibile con la lettura dello striscio ematico) e l’alterazione genetica della beta1 tubulina, descritta nel Cavalier King Charles Spaniel (la razza più frequentemente coinvolta), nel Norfolk e nel Cairn Terriers.

Ricordiamo che in queste razze, per valutare l’adeguatezza della massa piastrinica, è più indicativo il piastrinocrito (PCT) rispetto alla concentrazione piastrinica. Aggiungiamo che anche gli Akita Inu presentano spesso una trombocitopenia idiopatica di razza, dalle cause ancora poco note, ma clinicamente poco rilevante.

L’ulteriore passo diagnostico è differenziare tra ITP primaria e ITP secondaria. Le principali malattie infettive che possono provocare ITP secondaria sono quelle causate da Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia canis, Babesia gibsoni, e Leishmania infantum. Inoltre, sebbene non accuratamente documentato nel cane ma dimostrato nell’uomo, l’infezione da Helicobacter pylori potrebbe essere causa di ITP secondaria e, nei soggetti con concomitanti sintomi gastroenterici, è consigliato escluderla.

I linfomi e le leucemie sono le patologie neoplastiche più comunemente associate a ITP secondaria. La somministrazione di farmaci e vaccini è infine un’ulteriore potenziale causa di ITP secondaria.

Nonostante la mancanza di un gold standard, alcuni test di laboratorio possono fornire dati in supporto alla diagnosi di ITP.

- Con l’esame emocromocitometrico, il riscontro di una concentrazione piastrinica inferiore a 20.000 piastrine per microlitro è suggestivo di ITP primaria. La dimensione delle piastrine (mean platelet volume, MPV) ha scarsa utilità diagnostica, data la sua significativa variabilità nei pazienti con ITP. La presenza di piastrine di piccole dimensioni in questa patologia può essere il riflesso del fatto che, in alcuni cani, anche i megacariociti midollari sono direttamente coinvolti nella patologia autoimmune. Pertanto, concludono gli autori, un aumento di MPV (>12 fL, secondo uno studio) supporta la diagnosi di ITP, ma un MPV ridotto o nei limiti di riferimento non ne esclude la presenza.

- L’esame del midollo osseo non è raccomandato nell’iniziale approccio diagnostico alla ITP, fintantoché non diventa necessario per escludere altre patologie midollari (infettive o neoplastiche/displastiche). Infatti, l’eventuale iperplasia o ipoplasia della linea megacariocitaria associata alla ITP non sembra avere alcun significato diagnostico e prognostico. Può essere utile tuttavia per escludere rare forme caratterizzate dalla completa aplasia della serie megacariocitica.

- La misurazione degli autoanticorpi sierici (metodo indiretto) o legati alle piastrine per mezzo di metodiche di citofluorimetria (metodo diretto), sono test con sensibilità e specificità non ottimali per la diagnosi di ITP primaria: sono infatti sconsigliati anche dalle linee guida internazionali di ematologia umana. Il metodo diretto ha maggior accuratezza diagnostica rispetto al metodo indiretto, ma non è sufficiente per escluderne o confermarne la diagnosi. La ridotta specificità è dovuta al fatto che le piastrine possono legare anticorpi sulla loro superficie in modo aspecifico anche in assenza di patologia autoimmune e, inoltre, autoanticorpi sono possono essere presenti in caso di ITP secondaria. La presenza di ITP cellulo-mediata è invece il motivo di ridotta sensibilità, data la carenza o l’assenza di autoanticorpi in questa forma di ITP. Il test diretto rimane comunque utile nel monitoraggio del paziente in terapia: la persistenza di autoanticorpi nei soggetti che non rispondono in modo adeguato ai farmaci di prima linea può suggerire la modifica della terapia immunosoppressiva, mentre la riduzione o la scomparsa degli autoanticorpi può suggerire la progressiva riduzione dei farmaci immunosoppressivi.

- La misurazione della trombopoietina potrebbe essere potenzialmente utile dal punto di vista diagnostico e prognostico, ma questo test è eseguibile al momento solo nei laboratori di ricerca in medicina umana e non esiste un test specifico canino.

In sostanza, la ITP va sospettata in tutti quei cani in cui sussista una persistente e grave piastrinopenia. L’esclusione di altre patologie (es. sequestro splenico in corso di neoplasia della milza, malattie infettive in grado di determinare ipoplasia midollare, leucemie, ecc.) e la risposta terapeutica ai farmaci immuno-soppressori, restano il criterio diagnostico fondamentale, non avendo a disposizione test di conferma affidabili.

Marco Giraldi & Walter Bertazzolo, team di MYLAV

L’ESAME BATTERIOLOGICO NEL PAZIENTE AVIARE

La microbiologia è uno strumento importante per conoscere e valutare lo stato di salute del paziente aviare. Il materiale biologico per l’esame colturale deve essere raccolto in modo adeguato utilizzando dei tamponi sterili da conservare in terreno di trasporto.

Cosa è possibile campionare?

I siti più comuni da cui è possibile prelevare campioni per la batteriologia sono le coane, il gozzo, gli occhi, le orecchie, la pelle e la cloaca. In corso di infezione dei seni paranasali o di tumefazioni articolari si può campionare il materiale presente tramite centesi. La valutazione della cavità celomatica per via endoscopica può evidenziare la presenza di granulomi a livello di una o più strutture anatomiche, ad esempio, è utile ricorrere all’esame microbiologico in corso di infezione dei sacchi aerei, ovariti, orchiti e granulomi a carico dei polmoni.

Durante il campionamento che accortezze bisogna avere?

Prima di campionare la cloaca, il gozzo e le coane è consigliabile inumidire il tampone con soluzione salina sterile. Questa procedura permette di limitare il trauma meccanico alla mucosa dei tessuti indotto dallo sfregamento del tampone. Il tampone cloacale è da preferirsi a quello fecale perché la contaminazione da microrganismi ambientali è ridotta, quando si pratica il campionamento dalla cloaca è possibile ritrovare alcune gocce di sangue sul tampone o nelle deiezioni del pappagallo.

Come si esegue il campionamento dall’articolazione?

Il paziente deve essere sedato, successivamente si prepara la zona anatomica asetticamente e si inserisce un piccolo ago in articolazione per prelevare il liquido. Il materiale raccolto viene distribuito sul tampone e conservato nel terreno di trasporto.

Ci sono altre applicazioni della microbiologia nei pazienti aviari?

Un’applicazione molto importante è il monitoraggio della situazione microbiologica all’interno di un allevamento. È fondamentale controllare gli animali durante il periodo di quarantena, studiare lo stato di salute dei riproduttori, campionare le uova non schiuse, i soggetti morti, quelli che crescono in modo stentato e i soggetti svezzati in camera calda dall’allevatore con tecniche di alimentazione artificiale.

In caso di particolari richieste o domande, vi invitiamo a contattare i nostri consulenti di settore.

Gustavo Picci, consulente di Mylav per gli animali non convenzionali.

L’UTILIZZO DELLA SPETTROSCOPIA PER L’ANALISI DEI CALCOLI

Lo studio della composizione dei calcoli urinari nel cane e nel gatto, viene sfruttato clinicamente per la gestione delle urolitiasi (es. per modificazioni della dieta e dell’apporto in sali ed acqua, o mediante l’introduzione di integratori specifici che ne riducano la probabilità della recidiva).

Ma come viene valutata la composizione chimica di queste formazioni?

Ci sono diverse possibilità analitiche, ma il primo step è comune a tutte e sta nella selezione e preparazione del campione. L’urolita o gli uroliti devono essere frantumati e/o sezionati in modo da campionarne una piccola porzione, magari selezionandone aree diverse (soprattutto quando sono molto voluminosi) nel nucleo o nella porzione più esterna. Utilizzando un mortaio ed un pestello, vengono quindi ridotti in polvere.

A questo punto, questa polvere può venir analizzata mediante diverse metodologie.

Una prima possibilità è quella di utilizzare dei kit di analisi chimica, che attraverso una serie di reazioni piuttosto semplici permette in molti casi di individuare la composizione del calcolo analizzato. Purtroppo questa metodica, a fronte di costi di esercizio molto bassi e senza necessità di strumentazioni complesse, ha dei limiti analitici, in quanto è accurata nella rilevazioni di alcune sostanze (es. struvite, ossalati) mentre è molto più fallace nel rilevarne altre (es. xantina, cistina).

Una seconda possibilità è quella di utilizzare tecniche di diffrazione a raggi X o la spettroscopia infra-rossa (IR). Queste ultime due teconologie hanno mostrato accuratezza analitica simile pertanto, a fronte di una mancanza di problemi di sicurezza sul lavoro (che invece affliggono le tecnologie a raggi X), la spettroscopia IR ha ormai soppiantato tutte le altre tecnologie nella maggior parte dei laboratori di analisi umani.

Anche il nostro laboratorio utilizza attualmente questa metodologia. Il calcolo urinario polverizzato viene analizzato direttamente (spettroscopia ATR – a Riflettanza Totale Attenuata) o dopo miscelazione con KBr (spettroscopia FT-IR – Spettroscopia a Trasformata di Fourier), mediante un raggio di luce IR. Quando gli atomi di un composto inorganico o di una molecola organica vengono investiti da una radiazione IR, subiscono della alterazioni strutturali transitorie che generano degli spettri di assorbimento rilevati dallo strumento, che sono una sorta di impronta digitale di ogni gruppo chimico.

Lo strumento, rilevando questo spettro specifico, lo confronta con un database di migliaia di altri spettri riconducibili a vari tipi di sostanze organiche ed inorganiche. In questo modo in pochi secondi, è in grado di determinare la sostanza o le sostanze che compongono il calcolo da esaminare.

Nell’esempio in figura, si osservi lo spettro del campione (in rosso in alto) paragonato con uno di confronto del datatabase (in blu in basso, in questo caso riferito all’ossalato di calcio).

Walter Bertazzolo, Direttore Scientifico di Mylav

LA COLORAZIONE CITOCHIMICA PER LA RIVELAZIONE DELLA FOSFATASI ALCALINA (ALP) NEGLI OSTEOSARCOMI

La diagnosi definitiva di osteosarcoma (OSA) è basata sui rilievi istopatologici (presenza di una proliferazione mesenchimale neoplastica in grado di produrre sostanza osteoide). L’esame citologico in caso di OSA, può essere in grado di diagnosticare una neoplasia mesenchimale ma spesso non permette una caratterizzazione definitiva, in quanto le cellule neoplastiche possono essere simili a quelle di altre neoplasie mesenchimali, melanocitarie o anche a plasmacellule neoplastiche.

Una particolare colorazione citochimica di preparati già precedentemente colorati con metodiche citologiche di routine, ci può venire in aiuto in questi casi, confermando l’origine osteoblastica della proliferazione neoplastica. Gli osteoblasti normali così come quelli neoplastici, contengono fosfatasi alcalina (ALP) a livello membranario: utilizzando una specifica colorazione con BCIP/NBT (5-Br, 4Cl, 3-indolil-fosfato/tetrazolio nitroblu), la ALP catalizza la formazione di uno specifico prodotto colorato insolubile scuro, che si può facilmente visualizzare sulle cellule di derivazione osteoblastica (vedi figure 1 e 2).

Figura 1 e 2 - Le cellule positive (in questo caso osteoblasti neoplastici da una lesione osteolitica) mostrano un precipitato scuro sulla membrana cellulare.

Alcuni anni fa, uno studio pubblicato sul Veterinary Clinical Patology (Ryseff & Bohn, 41(3): 391-395) ha valutato l’applicazione di questa colorazione su casi di OSA e di altre neoplasie mesenchimali e melanocitiche (miopericitoma, schwannoma, fibrosarcoma, mixosarcoma, fibroma, angiosarcoma, melanoma, sarcoma anaplastico ed indifferenziato, GIST, sarcoma istiocitico). In questo studio quasi tutti gli OSA (88%) risultavano positivi per ALP mentre quasi tutte le altre neoplasie risultavano negative (vedi esempio in figura 3).

Trattandosi di una colorazione relativamente semplice e di indubbia utilità diagnostica, abbiamo deciso di testarla e quindi di introdurla tra i nostri servizi diagnostici in cito/istopatologia. Nel caso in cui voleste confermare il sospetto di OSA, sono sufficienti alcuni strisci citologici di buona qualità della sospetta neoplasia. È importante sottolineare che questa colorazione non permette di distinguere tra osteoblasti normali/reattivi e neoplastici, pertanto un esame citologico preliminare che confermi un processo neoplastico è necessario prima di procedere con la colorazione citochimica.

Walter Bertazzolo, Direttore Scientifico di MYLAV

Maria Massaro, servizio di cito/istopatologia di MYLAV

LA CISH PER L’IDENTIFICAZIONE DEGLI AGENTI EZIOLOGICI VIRALI

La tecnica di Ibridazione in situ cromogenica (CISH) permette di localizzare il DNA target nei tessuti e viene eseguita su sezioni allestite da paraffina, le stesse che vengono utilizzate routinariamente per eseguire un esame istologico o una immunoistochimica (IIC) a partire dalle biopsie. La differenza con un esame di IIC è che, mentre questo si basa sull’identificazione di antigeni mediante un legame anticorpale specifico, la CISH rileva il DNA da ricercare tramite delle sonde oligonucleotidiche specifiche.

La sua applicazione in dermatologia veterinaria è stata validata recentemente per alcune malattie virali del gatto: la dermatite herpetica (causata da Feline Herpes Virus-1) e le placche virali/carcinoma in situ Bowenoide o BISC (Bowenoid In-Situ Squamous Cell Carcinoma, causate da un Feline Papilloma Virus).

Nella dermatite herpetica è molto difficile, con il solo esame istopatologico, emettere una diagnosi di certezza in quanto i corpi inclusi possono essere pochi e di difficile rilievo. L’esame di PCR convenzionale rileva il DNA virale ma non è in grado di discriminare tra un eventuale stato di latenza, presenza di virus vaccinale o infezione. Dal momento che con la CISH viene conservata la morfologia cellulare, è possibile verificare la localizzazione del DNA virale e la sua distribuzione nell’ambito di una lesione cutanea, identificando il ruolo del virus nella genesi della lesione (Figura 1).

Per quanto riguarda le placche virali /BISC, l’esame istopatologico è derimente nel verificare la presenza delle lesioni e il sospetto che queste siano di origine virale, deriva dal riscontro dei coilociti, effetto citopatico dei papillomavirus.

La CISH, anche in questo caso, preservando la morfologia cellulare, evidenzia il DNA virale nelle cellule, permettendo di verificarne la presenza nelle aree carcinomatose, nelle placche e anche in aree di cute che apparentemente possono sembrare normali (Figura 2).

Tra i diversi FcaPV (1-2-3-4-5), l’FcaPV-2 è quello maggiormente implicato nell’insorgenza di placche virali e BISC.

Da quest’anno possiamo offrirvi questo nuovo servizio diagnostico all’avanguardia a partire da biopsie istologiche di casi sospetti.

Francesca Abramo & Silvia Benali, staff dei patologi di MYLAV

IL CAMPIONAMENTO IN MICROBIOLOGIA – PARTE 5

Cari colleghi, parliamo oggi delle metodiche di corretto campionamento per eseguire un esame microbiologico delle urine.

La metodica d’elezione per la raccolta del campione è la cistocentesi. Questa procedura permette di prelevare sterilmente l’urina direttamente dalla vescica e quindi riduce il rischio di contaminazione dalle basse vie urinarie.

Sono ammessi cateterismo e minzione spontanea ma ovviamente si avrà maggior rischio di contaminazione. In base alla metodica di prelievo il laboratorio interpreterà diversamente la crescita ottenuta, secondo appositi cut-off che ne stabiliscono la significatività. Ad es. un’urina prelevata per cistocentesi, se presenta una crescita di 150 UFC/mL viene considerata positiva, invece un’urina presa per minzione spontanea, se presenta una crescita di 150 UFC/mL verrà considerata negativa.

Affinché il laboratorio possa eseguire la conta delle unità formanti colonia su mL (UFC/mL), e quindi possa eseguire un’urinocoltura quantitativa, deve avere a disposizione un certo quantitativo di urina (almeno 1mL). Al di sotto di questa quantità non è possibile effettuare una semina quantitativa, e come abbiamo visto, questo ci impedisce di stabilire se la crescita avvenuta è significativa o meno, per quella determinata metodica di prelievo.

Il prelievo mediante cateterismo deve essere effettuato con catetere sterile e cercando di rispettare il più possibile una procedura asettica, per evitare contaminazioni del campione o peggio ancora infezioni iatrogene successive. In caso di prelievo mediante cateterismo permanente (es. gatto ostruito), il catetere deve essere stato appena introdotto o introdotto da poco. Già dopo poche ore sulla parete del catetere tende a formarsi un biofilm batterico ambientale che contaminerà il prelievo di urina.

In caso di prelievo per minzione spontanea, cercare se possibile di evitare il primo getto e raccogliere il getto intermedio.

Per i sopracitati motivi, è fondamentale segnalare al laboratorio la metodica con cui è stato prelevato il campione.

Le urine vanno inviate al laboratorio direttamente nella siringa sterile o in una provetta sterile (ed in questi casi vanno mantenute refrigerate) oppure, scelta consigliata, in appositi contenitori sterili per urine PENTADIP o TRISLIDE (questi ultimi contengono già dei terreni differenziali) o in ultimo provette con acido borico (stabilizzante per la crescita batterica). In questi ultimi due casi invece l’urina va conservata a temperatura ambiente. Questi contenitori possono essere richiesti direttamente al laboratorio.

Vanno evitati i contenitori non adeguati, ad es. provette non sterili, provette da siero, tamponi con terreno di trasporto (i campioni liquidi facilmente fuoriescono e spesso la quantità raccolta è inadeguata) o peggio ancora barattoli riciclati.

Marta Medardo, Responsabile del settore di Microbiologia di MYLAV

IL CAMPIONAMENTO IN MICROBIOLOGIA: PARTE 6

Cari colleghi, parliamo oggi delle metodiche di corretto campionamento per eseguire una coprocoltura.

Innanzitutto tenete presente che la coprocoltura prevede svariati brodi di coltura e terreni diversi; questo significa che il campione va diviso per ciascun terreno/brodo durante la processazione quindi in genere sono necessari almeno 5 gr di feci. Il tampone rettale è quindi sconsigliato poiché non raccoglie una quantità sufficiente di materiale.

Il campione va raccolto nella maniera più pulita possibile (non dalla terra del giardino per intenderci) e va messo in un barattolo sterile. È preferibile utilizzare campioni freschi, raccolti entro le 24h poiché la conservazione e le rapide variazioni di pH possono contrastare l’isolamento di determinati patogeni.

Altra cosa fondamentale: la coprocoltura andrebbe fatta nel momento in cui le feci non sono formate. Se le feci sono completamente formate, difficilmente avremo dei campioni significativi.

Ricordiamo infine che numerosi microrganismi potenzialmente patogeni (Shigella, Salmonella, Campylobacter, ecc.) possono essere isolati anche da soggetti sani e la loro presenza non è detto che possa essere associabile ad una sintomatologia clinica.

Marta Medardo, responsabile del settore di Microbiologia di MYLAV

SCOPRIAMO I SEGRETI DELL’EMOCROMO MYLAV – PARTE 9

Nella precedente puntata abbiamo iniziato a descrivere la valutazione delle piastrine che viene effettuata nei nostri emogrammi. Abbiamo quindi già discusso la conta totale e la stima piastrinica. Vediamo cosa ci possono dire invece quegli acronimi dall’oscuro significato che compaiono immediatamente sotto la voce PLT (numero totale di piastrine). Va premesso che per questi indici piastrinici non esistono molti dati pubblicati in letteratura nelle specie di interesse veterinario.

MPV (Mean Platelet Volume) è il volume medio delle piastrine misurato direttamente dallo strumento. Va sottolineato che la maggior parte degli analizzatori di ematologia non può misurare accuratamente tale indice, per intrinsechi limiti tecnici. L’ADVIA 2120 che utilizziamo nel nostro laboratorio riesce invece a determinare l’MPV in maniera accettabile. Questo perché con la sua tecnologia riesce a misurare anche le piastrine voluminose, che con altre contaglobuli verrebbero invece confuse con gli eritrociti. Da punto di vista clinico, l’MPV non è particolarmente utile, ci dice semplicemente quanto sono mediamente grandi le piastrine di quel paziente. Però serve per calcolare un valore più importante, il PCT (piastrinocrito), che viene determinato moltiplicando il numero di di piastrine per il loro volume medio (PLT x MPV). Il PCT rappresenta per le piastrine quello che l’HCT è per gli eritrociti, per cui è un indicatore della massa piastrinica circolante. Il PCT può essere utile specialmente in quei cani che hanno una piastrinopenia con macropiastrine, fisiologica (es. i cavalier King Charles spaniels) o patologica. Un valore di PCT normale esclude quindi una piastrinoipenia reale, anche se la conta piastrinica risultasse bassa. Impariamo a darci sempre un occhiata nei casi dubbi.

L’MPC è il “Mean Platelet Component Concentration”: questo indica il contenuto medio (granularità) delle piastrine. Sebbene ci siano pochi dati in letteratura veterinaria, si è osservata una riduzione dell’MPC in corso di attivazione piastrinica (degranulazione), per esempio in corso di grave infiammazione/sepsi nel cavallo o nell’anemia emolitica immuno-mediata del cane.

L’indice “MPM” misura la Mean Platelet Dry Mass, ovvero la massa secca occupata dalle piastrine. Su questo dato purtroppo non ci sono grosse informazioni bibliografiche.

I valori indicati con la “W” stanno ad indicare l’ampiezza (Width) dei singoli indici, ovvero quanto sono difformi tra loro le piastrine per volume (PDW), contenuto in granuli (PCDW) e massa secca (PMDW).

Infine il termine Large PLT indica la quantità di piastrine con volume superiore ad una determinata soglia (ovvero quante sono le piastrine troppo grandi per quella specie).

Nella prossima puntata ci concentreremo sulla valutazione dei reticolociti e quindi sulla capacità rigenerativa del paziente in esame.

Walter Bertazzolo

SCOPRIAMO I SEGRETI DELL’EMOCROMO MYLAV – PARTE 10

Ci occuperemo oggi di un aspetto molto importante dell’emogramma: ovvero come valutare la rigenerazione.

La valutazione della capacità rigenerativa in corso di anemia è molto importante per il clinico in quanto gli permette di indirizzare il suo iter diagnostico in due opposte direzioni:

- Forme rigenerative: da perdita ematica o ridotta vita media degli eritrociti (emolisi)

- Forme non rigenerative: tutte le altre cause di anemia.

Figura – reticolociti colorati con metodo sopravitale (Nuovo Blu di Metilene)

In questo senso la valutazione dell’emogramma, per quel che concerne la componente reticolocitaria, deve essere letta con attenzione tenendo conto di una serie di importanti accorgimenti:

A) Prima di affermare con certezza se una anemia è rigenerativa o meno, sarebbe sempre meglio ricontrollare l’emogramma a distanza di alcuni giorni in caso di una forma apparentemente non rigenerativa. Il midollo infatti necessita almeno 3-5 giorni di tempo, dopo un evento anemizzante, prima di giungere ad una adeguata produzione reticolocitaria. L’andamento della concentrazione di reticolociti nel tempo è quindi molto più importante della singola determinazione.

B) La rigenerazione può essere valutata con tre diversi numeri: la % di reticolociti (e la sua controparte corretta in base all’ematocrito, il cosidetto CRP – Corrected Reticulocyte Percentage), il numero complessivo di reticolociti/uL e l’indice di produzione reticolocitaria (RPI, Reticulocyte Production Index). Sebbene non esistano dei cut-off assoluti, possiamo affermare che più è alta la quantità di reticolociti (e quindi quanto più alti sono la %, il CRP e l’RPI), più è elevata la spinta midollare e quindi la rigenerazione.

C) Il cane ed il gatto non hanno la stessa capacità di rigenerezione, per cui i termini di riferimento da considerare sono un po’ differenti.

D) L’introduzione e la diffusione delle contaglobuli laser ha reso molto più semplice ed accurata la conta reticolocitaria, rispetto ai tradizionali metodi manuali, basati sulle colorazioni sopravitali come il nuovo blu di metilene. Queste ultime avevano infatti una ripetibilità ed una accuratezza complessiva nettamente inferiore, in particolare nel gatto, nel quale la discriminazione tra reticolociti puntati ed aggregati è tutt’altro che agevole e la loro interpretazione molto fuorviante. Per tale ragione noi preferiamo attualmente evitare di suddividere le conte reticolocitarie in puntati ed aggregati nella specie felina, e di affidarci quindi solo alla conta automatica, molto più affidabile.

E) Nel complesso, coi dati attualmente in nostro possesso, possiamo dire che nel cane può essere considerata sicuramente rigenerativa una anemia in cui il numero di reticolociti totali supera i 70.000/uL (se con conta manuale, mentre questo cut-off è probabilmente più elevato se si utilizzano i laser, vedi in particolare i nostri intervalli di riferimento, sebbene non vi siano ancora dati definitivi a riguardo), oppure con un RPI>1. Un recente studio pubblicato da Paltrinieri et al (JAVMA 2016), ha mostrato tuttavia che l’utilizzo dei valori di riferimento indicati dal laboratorio della % di reticolociti, del numero di reticolociti totali e del RPI quali cut-off per discriminare tra una forma rigenerativa da una non rigenerativa, mostravano una buona specificità ma una sensibilità piuttosto insoddisfacente. Pertanto gli autori dello studio proponevano i seguenti cut-offs in caso di conta laser automatizzata: >2,3% di reticolociti, >86000 reticolociti/uL e RPI >0,4.

F) Nel gatto invece, in base a un recente lavoro pubblicato da Paltrinieri et al sul Feline Medicine and Surgery (2018), è da considerarsi rigenerativa una anemia con un numero di reticolociti totali > 60.000/uL, una % di reticolociti>3% e un RPI >0,6 (sempre utilizzando il conteggio automatico mediante contaglobuli laser).

Infine, come potete vedere nello screen-shot sopra, ripreso da un nostro normale emogramma, è anche riportato un rapporto tra reticolociti ed nRBC, che dovrebbe essere superiore ad 1. Cosa significa? In condizioni di rigenerazione normale, il midollo immette in circolo elevate quantità di reticolociti ma anche alcuni nRBC, pertanto il rapporto tra questi è solitamente di molto superiore ad 1. In fase di rigenerazione iniziale, può invece capitare di avere inizialmente un numero di nRBC eccessivamente alto rispetto ai reticolociti: è una situazione normale dovuta al fatto che il midollo inizialmente rilascia globuli rossi nucleati immaturi per effetto della spinta rigenerativa, che come già sottolineato necessità di almeno 3-5 giorni per ottimizzare la produzione di reticolociti. In alcune condizioni eritrodisplastiche invece (es. nella FeLV del gatto), è comune osservare una persistente condizione anomala, in cui a dispetto di una reticolocitosi pressoché assente, sono presenti in circolo nRBC, per cui questo rapporto è costantemente inferiore ad 1.

Walter Bertazzolo, Direttore Scientifico di MYLAV

SCOPRIAMO I SEGRETI DELL’EMOCROMO MYLAV – PARTE 11

In quest’ultima puntata dedicata alla spiegazione dei nostri emogrammi, ci occuperemo della parte più ostica, quella colonna centrare che raccoglie tutti i dati relativi alla valutazione dei reticolociti (vedi screenshot a sinistra). Va premesso che per molti di questi dati numerici non esistono consistenti informazioni in letteratura per il cane ed ancora meno per il gatto, per cui la loro interpretazione va fatta con cautela.

Lo strumento da noi utilizzato (ADVIA 2120) processa i reticolociti colorandoli con uno speciale reagente (oxazina 750) che si lega all’RNA contenuto nel loro citoplasma: quando vengono passati al lettore laser, i reticolociti vengono identificati e distinti dagli altri eritrociti maturi, in quanto assorbono più luce e hanno fluorescenza proporzionata a tale assorbimento.

Quindi scendendo dall’alto verso il basso nella colonna centrale, dopo la quantificazione percentuale ed assoluta dei reticolociti (di cui abbiamo già parlato in una precedente puntata), incontriamo la quantificazione in base a questo principio discriminatorio.

Così come per gli eritrociti maturi, anche i reticolociti possono infatti venir analizzati in base al loro volume, al loro contenuto e concentrazione in emoglobina e alla quantità di RNA (con alta fluroescenza sono quelli più giovani e con più RNA, con bassa fluorescenza sono quelli che stanno maturando a eritrociti normali e hanno quindi meno RNA). Le lettere L (“Low), M (“Medium”) ed H (“High”) stanno proprio ad indicare la distribuzione percentuale e i valori assoluti di queste tre frazioni di reticolociti. Tendenzialmente possiamo presupporre che più sono numerosi quelli ad elevata fluorescenza, più significa che il midollo sta producendo attivamente giovani eritrociti e viceversa. Questo dato viene chiamato “Immature Reticulocyte Fraction” (IRF) e prende per l’appunto in considerazione la frazione di reticolociti ad alta (IRF-H) e media/alta (IRF-H+M) fluorescenza rispetto al numero di reticolociti totali.

Scendendo ulteriormente la colonna centrale, incontriamo i valori degli indici eritrocitiari divisi per popolazioni. Lo strumento è infatti in grado di rielaborare tutti gli indici eritrocitari (MCV, MCH, MCHC, CH, ecc.) che troviamo anche nella colonna a sinistra (nella quale, come spiegato in un blog precedente, sono riferiti a tutti gli eritrociti complessivi). In questo caso però gli indici vengono analizzati suddividendoli tra gli eritrociti maturi (quelli indicati con la lettera “m”) e i reticolociti (indicati con la lettera “r”). I valori indicati con la lettera “g” (gated) sono invece riferiti alla popolazione eritrocitaria totale analizzata, e sono approssimativamente molto simili a quanto riportato nella colonna sinistra. Tra questi indici, troviamo alcuni interessanti dati, in quanto abbiamo alcuni riferimenti bibliografici per la specie canina. In particolare è stato osservato in alcuni studi, che in corso di anemia da carenza di ferro in fase iniziale, prima che diminuiscano i valori assoluti di MCV, MCH ed MCHC, tendono a ridursi precocemente i corrispondenti valori reticolocitari, in particolare l’MCVr, il CHr e il CHCMr. Quindi bisogna incominciare ad abituarsi a controllare questi indici nei cani anemici per verificare se stanno andando incontro ad una carenza iniziale di ferro.

Infine, gli ultimi indici (% Micro_g, % Micro_r, ecc.) stanno ad indicare le frazioni delle diverse popolazioni di globuli rossi (totali, maturi e reticolociti) che sono più piccoli, più grandi, con più o meno emoglobina rispetto a determinati valori soglia. Danno pertanto una idea di come sono distribuite tra loro le diverse frazioni di globuli rossi nel campione analizzato.

Walter Bertazzolo, Direttore Scientifico di MYLAV

RINGRAZIAMENTI

Ringraziamo per il loro impegno tutti gli Autori dei Post, i Consulenti Scientifici MYLAV – La Vallonea e coloro che curano la redazione del nostro Blog di Aggiornamento Scientifico.

Ringraziamo tutti i nostri Clienti che, seguendoci e dandoci supporto, ci permettono di proseguire nello sviluppo di tutte le attività e servizi, fra cui il servizio di Consulenza ed Aggiornamento Scientifico, di cui siamo molto fieri.

Table of Contents

cover

consulenti

PRESENTAZIONE

COME EFFETTUARE UN CORRETTO CAMPIONAMENTO PER LA RICERCA DI DERMATOFITI

LA RICERCA DELLE METASTASI LINFONODALI: QUANTO È ACCURATA LA CITOLOGIA?

È POSSIBILE PREDIRE IL GFR DALLA CREATININA SIERICA?

COME GESTIRE LE INFEZIONI COMPLICATE DEL TRATTO URINARIO

IL CAMPIONAMENTO IN MICROBIOLOGIA

L’EFFETTO DELLA LIPEMIA SULL’ELETTROFORESI

LA PROTEINURIA NEL PAZIENTE NEFROPATICO CRONICO

LA PROTEINURIA NEL PAZIENTE NEFROPATICO CRONICO

QUALI INFORMAZIONI CI PUÒ FORNIRE LA CHIMICA URINARIA

VALUTAZIONE DELL’IMMUNITÀ VACCINALE E CORTISONICI

COME QUANTIFICARE LA PROTEINURIA

L’EFFETTO DELLA CONTAMINAZIONE EMATICA SULL’ESAME DEL LIQUOR

ACIDI BILIARI SIERICI O URINARI: QUALI SCEGLIERE?

SEI SICURO CHE CI SIA UN PROBLEMA COAGULATIVO?

IL CONSENSUM DELL’ACVIM SULLA DIAGNOSI DELLE ANEMIE EMOLITICHE IMMUNOMEDIATE

IL CONSENSUM DELL’ACVIM SULLA TERAPIA DELL’ANEMIA EMOLITICA IMMUNOMEDIATA

AGGIORNAMENTI TERAPEUTICI SUL MORBO DI ADDISON

GLI ESAMI DI LABORATORIO NEL MONITORAGGIO: ALCUNI CONSIGLI PRATICI

LA VALUTAZIONE QUALITATIVA DELLA PROTEINURIA CON SDS-AGE NEL PAZIENTE NEFROPATICO CRONICO

QUANDO LA TERAPIA VI IMPEDISCE LA DIAGNOSI

IL SIGNIFICATO DELL’EMOFAGOCITOSI IN CITOLOGIA

ESAME DELLE URINE CON STRISCETTE: COME LO FATE ?

FLUTD: ANTIBIOTICI SI, ANTIBIOTICI NO

IL CALIBRO DELL’AGO INFLUENZA I RISULTATI DI UNA CITOLOGIA?

FINALMENTE FORSE LA PERITONITE INFETTIVA (FIP) POTRA’ ESSERE CURATA?

IDENTIFICAZIONE DEI MICRORGANISMI MEDIANTE MALDITOF: COS’È E COME FUNZIONA?

SI POSSONO DIFFERENZIARE LE NEOPLASIE EPATOIDI BENIGNE DA QUELLE MALIGNE CON LA CITOLOGIA?

UN GATTO CON INFEZIONI RICORRENTI

LE GLOMERULOPATIE IMMUNO MEDIATE DEL GATTO NON SONO POI COSI’ RARE

IL CORRETTO ALLESTIMENTO DI UN CAMPIONE ISTOLOGICO – PARTE 1: FISSAZIONE

NOVITA’ NELL’IPOTIROIDISMO CANINO

PRELIEVO EMATICO NEGLI UCCELLI

LA FIP È ANCORA UN DILEMMA DIAGNOSTICO

EUCAST E LINEE GUIDA EUROPEE

LA TROMBOCITOPENIA IMMUNOMEDIATA DEL CANE: UN UPGRADE

L’ESAME BATTERIOLOGICO NEL PAZIENTE AVIARE

L’UTILIZZO DELLA SPETTROSCOPIA PER L’ANALISI DEI CALCOLI

LA COLORAZIONE CITOCHIMICA PER LA RIVELAZIONE DELLA FOSFATASI ALCALINA (ALP) NEGLI OSTEOSARCOMI

LA CISH PER L’IDENTIFICAZIONE DEGLI AGENTI EZIOLOGICI VIRALI

IL CAMPIONAMENTO IN MICROBIOLOGIA – PARTE 5

IL CAMPIONAMENTO IN MICROBIOLOGIA: PARTE 6

SCOPRIAMO I SEGRETI DELL’EMOCROMO MYLAV – PARTE 9

SCOPRIAMO I SEGRETI DELL’EMOCROMO MYLAV – PARTE 10

SCOPRIAMO I SEGRETI DELL’EMOCROMO MYLAV – PARTE 11

RINGRAZIAMENTI